以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5188 —2020 迟缓爱德华氏菌病检疫技术规范 Quarantine protocol for edwardsiellasisICS 65.150 CCS B 41 中华人民共和国海关总署 发 布2020 -12-30 发布 2021 -07-01 实施以正式出版文本为准以正式出版文本为准I SN/T 5188—2020前 言 本文件按照 GB/T 1.1— 2020 的规定起草。 本文件中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国重庆海关。 本文件主要起草人：杨俊、聂福平、李应国、刘生峰、王昱、王国民、李贤良、张雷、肖进文、 周庆。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5188—2020迟缓爱德华氏菌病检疫技术规范 1 范围 本文件规定了迟缓爱德华氏菌的分离与鉴定、聚合酶链式反应（PCR）和实时荧光 PCR 的检测 技术要求。 本文件适用于水生动物迟缓爱德华氏菌病检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语、定义和缩略语 本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。 E.tarda ：迟缓爱德华氏菌。 4 迟缓爱德华氏菌病 迟缓爱德华菌病，是由迟缓爱德华菌引起的水生动物疾病的统称。鱼类感染后主要出现肠道败血 症和肝肾坏死病。迟缓爱德华氏菌病流行病学、临床症状、病理变化等资料参见附录 A。 5 病原分离与鉴定 5.1 仪器设备 显微镜：10× ～ 100×。 5.2 培养基 5.2.1 血琼脂 : 见 B.1。 5.2.2 营养琼脂：见 B.2。 5.2.3 硫酸亚铁琼脂：见 B.3。 5.2.4 半固体琼脂：见 B.4。 5.2.5 丙二酸钠培养基：见 B.5。 5.2.6 蛋白胨水：见 B.6。 5.2.7 葡萄糖蛋白胨培养基：见 B.7。 5.2.8 赖氨酸脱羧酶培养基：见 B.8。 5.2.9 ONPG 培养基：见 B.9。 5.2.10 糖发酵管：见 B.10。以正式出版文本为准2 SN/T 5188—20205.2.11 可使用商业化的培养基。 5.3 病料的采集和处理 无菌采取适量患病动物肝、肾及病变组织，置于无菌离心管中，用无菌盐水冲洗，匀浆待用。如 不能立即进行检验，需将采集或处理的样品置 4 ℃～ 8 ℃条件下保存，且不超过 24 h。 5.4 分离培养 取样品匀浆，划线接种血琼脂平板，28 ℃ ±1 ℃培养 24 h ～ 48 h。 从中挑取灰白色、圆形、湿润、 呈半透明状的单菌落在普通营养琼脂平板上纯化培养。 5.5 染色镜检 将可疑菌进行革兰氏染色，于显微镜下观察。迟缓爱德华氏菌为革兰氏阴性短杆菌，无荚膜，无 芽胞，大小约为（0.5 μm～1 μm）×（1 μm～3 μm ）。 5.6 生化试验 5.6.1 氧化酶试验 取白色洁净滤纸蘸取菌落，加 1% 盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴，阳性者呈现粉红色，并逐渐加 深 ; 再加 1% α- 萘酚溶液一滴，阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色。阴性者于两分钟内不变色。或以毛 细吸管吸取试剂，直接滴加于菌落上，其显色反应与前述相同。 5.6.2 生化鉴定试验 氧化酶试验为阴性的可疑菌按附录 C 进行生化鉴定。 6 迟缓爱德华氏菌核酸检测 6.1 试剂和材料 6.1.1 水 应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 6.1.2 DNA 提取液 40 mmoL/L Tris-HCl，pH8.0 20 mmol/L 乙酸钠，1 mmol/L EDTA，1% SDS。 6.1.3 10×PCR 缓冲液 氯化钾（KCl）:500 mmol/L ；Tris HCl（pH 8.3）:100 mmol/L ；明胶 :0.1% ；MgCl2：15 mmol/L。 6.1.4 dNTPS dATP、dGTP、dTTP、dCTP 各 2.5 mmol/L。 6.1.5 Taq DNA Polymerase（5 U/ μl） 6.1.6 50×TAE 缓冲液 称取 484 g Tris，量取 114.2 mL 冰醋酸，200 mL 0.5 mol/L EDTA （pH 8.0） ，溶于水中，定容至 2 L。 分装后高压灭菌备用。以正式出版文本为准3 SN/T 5188—20206.1.7 DNA Marker 6.1.8 SYBR Green Ⅰ核酸染料 6.2 仪器和设备 6.2.1 PCR 仪。 6.2.2 电泳装置。 6.2.3 凝胶成像系统。 6.2.4 PCR 超净工作台。 6.2.5 高速台式离心机（转速 12 000 r/min 以上） 。 6.2.6 台式离心机（转速 2 000 r/min 以上） 。 6.2.7 微量可调移液器（2 μL、10 μL、100 μL、1 000 μL ）。 6.2.8 荧光定量 PCR 仪。 6.3 模板提取 6.3.1 煮沸抽提法 取待测样本（增菌培养液或分离菌落菌悬液）1 mL，加到 1.5 mL 离心管中，8 000 r/min 离心 4 min，吸弃上清液，加入 50 μL DNA 提取液，混匀后沸水浴 5 min， 12 000 r/min 离心 5 min，取上清 液保存于 -20 ℃备用，-70 ℃可长期保存。 6.3.2 试剂抽提法 取待测样本（增菌培养液或分离菌落菌悬液）1 mL，加到 1.5 mL 离心管中，8 000 r/min 离心 4 min，吸弃上清，加入 200 μL DNA 提取液，充分混匀后，12 000 r/min 离心 10 min。将上清液转移 到新离心管中，加入等体积的 Tris 饱和酚，混匀，12 000 r/min 离心 3 min。 取水层，加等体积的氯仿， 混匀，12 000 r/min 离心 3 min。取出上清用预冷 2 倍体积的无水乙醇沉淀，15 000 r/min 离心 15 min， 弃上清液。用 400 μL 70％的乙醇洗涤 2 次。真空干燥后，用 50 μL TE 或超纯水溶解 DNA，-20 ℃冰 箱放置备用，-70 ℃可长期保存。 6.3.3 试剂盒方法 使用等效的商业化细菌 DNA 提取试剂盒，并按其说明提取制备模板 DNA。 6.4 聚合酶链式反应（PCR） 6.4.1 引物 P1:5 ’- CATCGTCACCATTCACAGT-3’ P2:5’- CCTTAATCCCACCCTCATAG-3’ 扩增目的片段为 494 bp。 6.4.2 试验对照 空白对照以水代替 DNA 模板；阴性对照以非目标菌的 DNA 作为 PCR 反应的模板；阳性对照采 用含有检测序列的 DNA（或质粒）作为 PCR 反应的模板。 6.4.3 反应体系： 10×PCR 缓冲液 2.5 μL 10 μmol/L P1 1 μL以正式出版文本为准4 SN/T 5188—202010 μmol/L P2 1 μL dNTPs 2 μL DNA 模板 2 μL Taq DNA 聚合酶 0.5 μL 水 补齐至 25 μL 也可使用等效的商业化的 Taq预混酶并按其说明配制反应体系。 6.4.4 PCR 反应 将配制好的 PCR 管放入 PCR 反应仪内，循环条件设置见表 1。 表 1　循环条件设置表 预变性 扩增 循环数 后延伸 94 ℃ /5 min94 ℃ /30 s 52 ℃ /30 s 72 ℃ /30 s35 72 ℃ /10 min 6.4.5 电泳 用电泳缓冲液（1×TAE）制备 1% ～ 2% 琼脂糖凝胶（55 ℃～ 60 ℃时加入溴化乙锭至终浓度为 0.5 μg/mL，也可在电泳后进行染色） 。取 5 μL～1 0 μL PCR 扩增产物，分别和 2 μL 上样缓冲液混合， 进行点样，用 DNA Marker 做参照。3 V/cm ～ 5 V/cm 恒压，电泳 20 min ～ 40 min，电泳结果用凝胶 成像分析系统记录并保存 , 也可在 365 nm 波长紫外光下观察电泳结果。 6.4.6 质量控制 以下条件有一条不满足时，实验视为无效： a）空白对照：无扩增条带。 b）阴性对照：无扩增条带 c）阳性对照：有同预期大小一致的扩增条带。 6.4.7 结果判定 如待测样品未出现相应大小的扩增条带，则可报告该样品 PCR 检验结果为阴性。 如待测样品出现相应大小的扩增条带，则可报告该样品 PCR 检验结果为阳性。 对于阳性结果，可回收 PCR 产物测序，将测序结果同参考序列（参见附录 D）比对，也可将测 序结果提交 NCBI 网站进行 BLAST 分析。 6.5 实时荧光 PCR 6.5.1 引物和探针 S1 ：5 ’ - TGTTTGAGGTGGTGGATAA-3 ’ S2 ：5 ’ - TGTGAATGGTGACGATGA-3 ’ T1 ：5 ’ - CACCACATGGTGTTTGAG-3 ’ T2 ：5 ’ - CGATGATATCTTTGCAATAACC-3 ’ Probe ：5 ’ - FAM-CTTCGTCAATCGCGTTATCCACC-TAMRA 3 ’ 6.5.2 试验对照