以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5186 —2020 鲍脓疱病检疫技术规范 Quarantine protocol for abalone pustule disease 2020 -12-30 发布 2021 -07-01 实施ICS 05.150 CCS B 41 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5186—2020I前 言 本文件按照 GB / T 1.1— 2020 的规定起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国海口海关、中华人民共和国厦门海关。 本文件主要起草人：吴山楠、庞道标、郭书林、黄纪徽、冯斯敏、林道颖、张亮亮、陈平亚、 李丹丹。以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5186—20201鲍脓疱病检疫技术规范 1 范围 本文件规定了鲍脓疱病的临床诊断、病原分离、生化鉴定、PCR 检测法和荧光 PCR 检测法。 本文件适用于鲍脓疱病的病原检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB 4789.28 食品安全国家标准 食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB / T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB / T 18088 出入境动物检疫采样 GB / T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 SC / T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 概述 鲍脓疱病由河弧菌感染所致，主要感染 3 cm ～5 cm 的稚幼鲍，夏季连续高温季节发病频繁，持 续时间长，死亡率高，在海南省及全国各地造成极其严重的经济损失。河弧菌是一种嗜盐菌，革兰染 色阴性，顶端单鞭毛，具动力。本菌可产生肠毒素和细胞毒素。本菌对多数广谱抗菌药物敏感，但耐 青霉素及头孢类抗生素。 患脓疱病的鲍可见足肌上有若干个微微隆起的白色脓疱。脓疱的形状基本上为三角形，病灶是从 腹足的下表面开始逐渐扩大、深入到足的内部。 开始时，病灶较小，随着病程的进展，病灶逐渐扩大。 临床检疫要求参见附录 A。 5. 试剂和仪器设备 5.1 试剂 5.1.1 除另有规定外，试验所需所有化学试剂均应为分析纯。 5.1.2 试验用水应符合 GB / T 6682 中一级水的规格，用于 DNA 提取及 PCR 试验的试验用水需用灭 菌双蒸水。 5.1.3 培养基。以正式出版文本为准 SN/T 5186—202025.1.4 生化鉴定试剂：精氨酸二氢酶、赖氨酸脱梭酶、鸟氨酸脱梭酶、脲酶、糖发酵管、微量生化 管、生化鉴定试剂条或试剂盒等。 5.1.5 细菌基因组提取试剂盒。 5.1.6 PCR 引物序列如下： —— F1 ：5’-GCCTGACTCAAGCCATCTCAACCC-3’ ； —— R1 ：5’-CTGTTGGTTGCCGTCATACTGCCT-3’ 。 5.1.7 实时荧光 PCR 引物和探针： —— F2 ：5’-GACGCTTGGCAGTGTTCAAC-3’ ； —— R2 ：5’-GTGCATTCCACCATATTTTCTTACG-3’ ； ——探针：5’ （FAM）-TGTCAGCACGCCAATCAATCACCCG（TAMRA）-3’ 。 5.1.8 TBE 电泳缓冲液。 5.1.9 核酸染色剂。 5.2 仪器设备 5.2.1 冰箱。 5.2.2 培养箱。 5.2.3 普通 PCR 仪。 5.2.4 高速冷冻离心机。 5.2.5 天平。 5.2.6 荧光 PCR 仪。 5.2.7 生物安全柜。 5.2.8 电泳仪。 6. 实验室诊断 6.1 采样 将活鲍解剖，取出足、外套膜、生殖腺、肝胰腺、消化管等组织器官，研磨后备用。采样数量、 包装等可按照 GB / T 18088 或 SC / T 7 103 执行，输入国家或地区有特定要求的，按输入国家或地区 采样。 6.2 分离培养法 6.2.1 增菌 生物安全应符合 GB 19489 的相关规定。 将采集到的鲍组织加入含3 % N a C l的碱性蛋白胨水 （见B . 1 ）中 ，于3 6 ℃± 1 ℃培养 8 h～18 h。 6.2.2 接种 用接种环将培养液接种于 TCBS 培养基（见 B.2）上，于 36 ℃ ±1 ℃培养 18 h ～24 h。 6.2.3 纯培养 选取单个黄色菌落接种于营养肉汤培养基（见 B.3） ，于 36 ℃ ±1 ℃培养 18 h ～24 h。以正式出版文本为准 SN/T 5186—202036.2.4 初步鉴定 6.2.4.1 平板培养特性 在 36 ℃ ±1 ℃条件下培养 18 h ～24 h 后，河弧菌在 TCBS 上会出现黄色菌落。 6.2.4.2 革兰染色 选取纯培养后，按 GB 4789.28 对可疑菌落进行革兰染色，河弧菌为革兰阴性菌。 6.2.5 生化鉴定 经 6.2.4 初步确定为河弧菌的菌株，采用全自动生化鉴定系统或接种于添加有精氨酸二氢酶、赖 氨酸脱梭酶、鸟氨酸脱梭酶、脲酶、糖发酵管、氧化酶、吲哚等细菌微量生化鉴定管，置 36 ℃ ±1 ℃ 培养 48 h，按细菌微量生化鉴定管说明书判定。 赖氨酸脱梭酶、鸟氨酸脱梭酶、脲酶、VP 试验均为阴性；乳糖不发酵、不产 H2 S、葡萄糖产酸 不产气；精氨酸二氢酶、氧化酶均为阳性的样品判定为河弧菌阳性。 河弧菌主要生化鉴定结果见附录 C。 6.3 PCR 检测法 6.3.1 实验室要求 实验室操作按照 GB / T 19495.2 的要求进行。 6.3.2 核酸提取 取经过 6.2.3 培养后的培养液 100 μL 于离心管中，100 ℃沸水浴 10 min，12 000 g离心 3 min，取 上清液作为模板进行 PCR 检测，或保存于 -20 ℃备用。 也可采用商品化的细菌基因组提取试剂盒。 6.3.3 PCR 反应体系 采用 25 μL 的反应体系，反应设立阳性对照、阴性对照和空白对照。在 PCR 反应管中加入灭菌 双蒸水 15.3 μL，模板 1 μL，3 mmol / L 的 MgCl2 1.5 μL，10×PCR 缓冲液 2.5 μL，0.2 mmol / L 的 dNTP 0.5 μL， 5 U / μL的 Taq酶 0.2 μL，2.5 mmol / L 的引物 F1 和引物 R1 各 2 μL。 6.3.4 PCR 反应条件 94 ℃预变性 4 min ；94 ℃变性 1 min，56 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 2 min，30 个循环；72 ℃延伸 7 min ；4 ℃保温。 6.3.5 电泳 用 TBE 电泳缓冲液（见 B.4）配制 1% 的琼脂糖平板，加核酸 EB 染色剂（见 B.5） 。将 8 μL PCR 产物和 2 μL 样品缓冲液（见 B.6）混匀后加入凝胶孔，5 V / cm 电泳约 30 min，设立 DNA 分子量标准 物作对照，在紫外灯下或凝胶成像仪中观察结果。 6.3.6 PCR 结果判定 阳性对照在 332 bp 处出现条带，阴性对照和空白对照不出现条带，实验成立。 样品在 332 bp 处不出现条带，判定为阴性。样品在 332 bp 处出现条带，应切胶回收进行 DNA 测 序，参考序列见附录 D。以正式出版文本为准 SN/T 5186—202046.4 实时荧光 PCR 检测法 6.4.1 核酸提取 见 6.3.2 操作。 6.4.2 荧光 PCR 反应体系 采用 25 μL 的反应体系，反应设立阳性对照和阴性对照。在 PCR 反应管中加入灭菌双蒸水 8.4 μL， 荧光 PCR 反应混合液 12.5 μL，10 μmol / L 的引物 F2 和引物 R2 各 0.3 μL，10 μmol / L 的探针 0.5 μL， 模板 3 μL。也可在加样前配制反应体系，如有 n个样品，可配制 n+2 个反应体系，之后分装于各反 应管。 6.4.3 荧光 PCR 反应条件 第一阶段：95 ℃ 10 min，1 个循环；第二阶段：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 个循环，在 60 ℃ 退火延伸时搜集荧光。报告荧光设为 FAM，淬灭荧光设为 TAMRA，参照荧光设为 None（多重荧光 PCR 淬灭荧光可选 ECLIPSE） 。 6.4.4 荧光 PCR 结果判定 阴性对照无 Ct 值或 Ct 值≥ 40，阳性对照 Ct 值＜ 40 且出现 S 形扩增曲线，实验成立。 样品无 Ct 值或 Ct 值≥ 40，判定为阴性；样品 Ct 值＜ 40 且出现 S 形扩增曲线，判定为阳性。