以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5185 —2020 猪副伤寒检疫技术规范 Quarantine protocol for swine paratyphoid 2020 -12-30 发布 2021 -07-01 实施ICS 11.220 CCS B 41 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5185—2020I前 言 本文件是按照 GB / T 1.1— 2020 的规定起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、中华人民共和国潍坊海关、中华人民共和国深圳 海关、中华人民共和国合肥海关。 本文件主要起草人：张体银、郑腾、田国宁、白泉阳、花群义、宗凯、王武军、张志灯、 于师宇。以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5185—20201猪副伤寒检疫技术规范 1 范围 本文件规定了猪副伤寒的临床诊断、病原的分离和鉴定、酶联免疫吸附试验、聚合酶链式反应 和实时荧光聚合酶链式反应鉴定技术。 本文件适用于猪副伤寒临床诊断和实验室检疫。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB / T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB / T 18088 出入境动物检疫采样 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 术语、定义和缩略语 本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。 BSA 牛血清白蛋白（bovine serum albumin） DNA 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） dNTP 三磷酸脱氧核苷酸（deoxynucleoside triphosphate） EB 溴化乙锭（ethidium bromide） ELISA 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay） HRP 辣根过氧化物酶（horseradish Peroxidase） LPS 脂多糖（lipopolysaccharide） PCR 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） TBE 三羟甲基氨基甲烷 - 硼酸 - 乙二胺四乙酸（trihydroxymethyl aminomethane-boric acid- ethylene diamine tetraacetic acid） 4 临床诊断 4.1 临诊症状 4.1.1 急性败血性 体温突然升高（41 ℃ ～42 ℃） ，精神不振，食欲废绝。呼吸困难，耳根、胸前和腹下皮肤有紫红 色斑点，后期或有下痢。有时在出现临诊症状后 24 h 内死亡，但多数病程为 2 d ～4 d，病死率很高。 4.1.2 亚急性和慢性 病猪体温升高（40.5 ℃ ～41.5 ℃） ，精神不振，寒颤，喜钻垫草，扎堆，眼有粘性或脓性分泌物，以正式出版文本为准 SN/T 5185—20202少数角膜混浊，严重者发展为溃疡，甚至眼球被腐蚀。病猪食欲不振，初便秘后下痢，粪便淡黄色或 黄绿色，恶臭。被毛粗乱，贫血，长期拉稀，粪便含纤维素、坏死组织或饲料凝块。有的皮肤出现弥 漫性湿疹。生长发育不良，呈典型僵猪。 4.2 病理变化 4.2.1 急性型 主要为败血症变化。脾常肿大，色暗带有蓝色，坚实似橡皮，脾髓质不软化。肠系膜淋巴结索状 肿大，其他淋巴结也有肿大，呈大理石状。肝、肾也有不同程度的肿大、充血和出血，肝实质有时可 见黄灰色坏死点。全身黏膜、浆膜均有不同程度的出血斑点，肠胃黏膜可见急性卡他性炎症。 4.2.2 亚急性和慢性型 主要为坏死性肠炎。盲肠、结肠肠壁增厚，黏膜覆盖一层弥漫性坏死和腐乳状物质，呈糠麸状， 底部为红色、边缘不规则的溃疡面。肠系膜淋巴结索状肿胀，部分呈干酪样变。脾肿大。肝有时可见 黄灰色坏死点。 5 病原的分离和鉴定 5.1 仪器和设备 5.1.1 培养箱（37 ℃ ±1 ℃和 42 ℃ ±1 ℃） 。 5.1.2 高压灭菌器。 5.1.3 玻璃研磨器或组织匀浆机。 5.1.4 台式高速离心机。 5.1.5 Ⅱ级生物安全柜或者超净工作台。 5.1.6 水浴锅。 5.1.7 冰箱（2 ℃ ～4 ℃和 –20 ℃） 。 5.1.8 无菌吸管。 5.1.9 全自动微生物生化鉴定系统。 5.2 培养基和试剂 5.2.1 水：符合 GB /T 6682 中一级水的规格。 5.2.2 缓冲蛋白胨水（BPW） ，配制方法见 A.1。 5.2.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液，配制方法见 A.2。 5.2.4 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液，配制方法见 A.3。 5.2.5 科玛嘉沙门菌属显色培养基琼脂。 5.2.6 亚硫酸铋（BS）琼脂，配制方法见 A.4。 5.2.7 Hektoen Enteric（HE）琼脂，配制方法见 A.5。 5.2.8 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂，配制方法见 A.6。 5.2.9 胆硫乳（DHL）琼脂，配制方法见 A.7。 5.2.10 营养琼脂，配制方法见 A.8。 5.2.11 三糖铁（TSI）琼脂，配制方法见 A.9。 5.2.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基，配制方法见 A.10。 5.2.13 蛋白胨水、靛基质试剂，配制方法见 A.11。 5.2.14 尿素琼脂（pH 7.2） ，配制方法见 A.12。以正式出版文本为准 SN/T 5185—202035.2.15 氰化钾（KCN）培养基，配制方法见 A.13。 5.2.16 邻硝基酚 β-D 半乳糖苷（ONPG）培养基，配制方法见 A.14。 5.2.17 丙二酸钠培养基，配制方法见 A.15。 5.2.18 革兰氏阴性细菌鉴定卡。 5.2.19 沙门菌 O 和 H 诊断血清。 5.3 样品采集 取样按照 GB /T 18088 的规定执行。无菌采集存活动物的新鲜粪便或直肠棉拭子样品；病死或带 菌动物的肝脏、胆囊、脾脏及其他病变组织，盲肠扁桃体及肠内容物。 5.4 样品保存 样品均放入 4 ℃冰箱内保存，并在冷藏状态下 24 h 内送到指定实验室。 5.5 细菌分离 5.5.1 总则 涉及病原的检测应在二级生物安全实验室进行，样品保存和废弃物处理应按照 GB /T 19489 要求 进行。 5.5.2 非污染样品 取组织器官和胆囊内容物，无菌条件下选择 2 种选择性琼脂平板（科玛嘉显色培养基琼脂、HE 琼脂、XLD 琼脂、DHL 琼脂、BS 琼脂等）进行划线接种培养，同时将组织器官匀浆，1 ：10 的体积 接种 BPW，36 ℃ ±1 ℃培养 18 h ～24 h，之后再按 1 ：10 的体积转接 TTB 增菌液和 SC 增菌液，分 别于 42 ℃ ±1 ℃和 36 ℃ ±1 ℃培养 24 h 和 48 h 后，再选择 2 种同样的选择性琼脂平板划线接种培养， 若出现表 1 中的菌落特征，可以判为可疑菌落，挑取可疑菌落进一步鉴定。如果没有发现可疑菌落， 则判定为细菌分离为阴性。 表 1　沙门菌属在不同琼脂平板上的培养条件和菌落特征 培养基种类 培养条件 沙门菌菌落特征 科玛嘉显色培养基琼脂36 ℃ ±1 ℃培养 18 h～24 h菌落呈淡紫色至紫红色 HE 琼脂36 ℃ ±1 ℃培养 18 h～24 h蓝绿色或蓝色，多数菌落中心为黑色或全黑色；有些菌株为黄色，中心 为黑色或几乎全黑色 XLD 琼脂36 ℃ ±1 ℃培养 18 h～24 h菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中 心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心 DHL 琼脂36 ℃ ±1 ℃培养 18 h～24 h菌落为无色半透明带有黑色中心，有些菌落中心无黑色沉淀物 BS 琼脂36 ℃ ±1 ℃培养 40 h～48 h菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈现黑色或 棕色，有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基颜色不变 5.5.3 污染样品 将直肠棉拭子、新鲜粪便、盲肠扁桃体、肠内容物等污染样品（非液体性样品最好先制成匀浆 液） ，按 1 ：10 的体积接种 BPW，36 ℃ ±1 ℃培养 18 h ～24 h，其余步骤同 5.5.2.以正式出版文本为准 SN/T 5185—202045.6 生化试验 5.6.1 三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验 自选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于 底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于 36 ℃ ±1 ℃培 养 18 h～24 h，必要时可延长至 48 h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门菌属的反应 结果见表 2。 表 2　沙门菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果 三糖铁琼脂 赖氨酸脱羧酶试验 初步判断 斜面 底层 产气 硫化氢 K A +（-） +（-） + 可疑沙门菌 K A +（-） +（-） - 可疑沙门菌 A A +（-） +（-） + 可疑沙门菌 A A +/- +/- - 非沙门菌 K K +/- +/- +/- 非沙门菌 注： K ：产碱；A ：产酸；+ ：阳性；- ：阴性；+（-） ：多数阳性，少数阴性；+ / - ：阳性或阴性。 5.6.2 二次生化试验 根据 5.6.1