以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5184 —2020 禽副伤寒检疫技术规范 Quarantine protocol for avian paratyphoid 2020 -12-30 发布 2021 -07-01 实施ICS 10.040.65 CCS B 41 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5184—2020I前 言 本文件按照 GB / T 1.1— 2 009 给出的规则编制。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国长春海关。 本文件主要起草人：孟日增、刘韬、孟庆峰、石建平、冯博、王宁、曲辉。以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5184—20201禽副伤寒检疫技术规范 1 范围 本文件规定了禽副伤寒的临床诊断、病理学诊断、病原分离与鉴定技术、玻片凝集试验和聚合 酶链式反应（PCR 法） 。 本文件适用于进出境活鸡或散养鸡禽副伤寒现场诊断与实验室诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB / T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 生物安全措施 样品采集、样品处理及检验过程所涉及的实验操作和防护要求应符合 GB 19489 的规定。 5 诊断技术 5.1 临床诊断 雏鸡副伤寒以急性败血型为主，往往孵出后不久很快死亡，看不到明显症状，10 d 左右的雏鸡 发病后，精神委顿，怕冷，头和翅膀下垂，羽毛松乱，喜欢拥挤在温暖的地方，食欲废绝，烦渴， 下痢，排出水样稀粪，肛门周围常被稀粪沾污。有的发生眼炎、失明，有的表现为呼吸困难。常在 1 d～2 d 内死亡，死亡率 10% ～80%。 成年鸡感染后多不表现症状，成为慢性带菌者，肠道带菌的时间长达 9 ～16 个月。成年鸡感染后 厌食、下痢、脱水、全身衰弱、翅膀下垂和羽毛松乱，死亡率约 10%，大部分能在短期康复。 5.2 病理学诊断 剖检时， 最急性的往往病变不显著， 仅见肝脏淤血肿大，胆囊扩张， 充满胆汁。病程稍长的病鸡 死后显现消瘦、失水、卵黄凝固的症状。肝脏、脾脏发生淤血、有出血条纹或针尖大灰白色坏死点。 肾脏淤血。有心包炎，心包液增多， 含有纤维素性渗出物。小肠有出血性炎症， 尤以十二指肠最严重， 盲肠扩张，肠腔中有时有淡黄或白色干酪样物质堵塞。10 日龄以内幼雏常有肺炎病变。以正式出版文本为准 SN/T 5184—202025.3 病原分离与鉴定 5.3.1 试剂与材料 5.3.1.1 非选择性增菌液：缓冲蛋白胨水（BP） ，见 A.1。 5.3.1.2 选择性增菌液：亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC） 、四硫磺酸钠煌绿增菌培养基（TTB） 、RVS 大 豆蛋白胨增菌液（Rappaport-Vassiliadis soya peptone broth） ，见 A.2～A.4。 5.3.1.3 非选择性琼脂平板：血琼脂平板，营养琼脂平板，见 A.5～A.6。 5.3.1.4 选择性琼脂平板：亚硫酸铋琼脂（BS） 、胆硫乳琼脂（DHL） 、HE 琼脂（Hektoen Enteric Agar） 、木糖赖氨酸去氧胆酸盐琼脂（XLD） 、沙门氏菌显色培养基，见 A.7～A.11。 5.3.1.5 生化鉴定试剂：三糖铁琼脂、赖氨酸脱羧酶培养基、鸟氨酸脱羧酶培养基、尿素酶培养基、 半固体琼脂、糖发酵管、微量生化管、生化鉴定试剂盒或试剂条，见 A.12～A17。 5.3.1.6 诊断血清：A-F 多价 O 血清，O9 因子血清，O12 因子血清，H-a 因子血清，H-d 因子血清， H-g. m 因子血清和 H-g. p 因子血清。 5.3.1.7 蒸馏水：用于配制培养基和试剂的蒸馏水需符合 GB / T 6682 二级水的要求。 5.3.2 设备与器材 5.3.2.1 生物安全柜。 5.3.2.2 全自动微生物鉴定系统。 5.3.2.3 恒温培养箱：25 ℃ ±1 ℃，30 ℃ ±1 ℃，35 ℃ ±1 ℃。 5.3.2.4 恒温水浴锅：46 ℃ ±1 ℃。 5.3.2.5 均质器或灭菌乳钵。 5.3.2.6 显微镜：10× ～100×。 5.3.2.7 接种环、接种针。 5.3.2.8 锥形烧瓶。 5.3.2.9 灭菌试管：18 mm ～180 mm。 5.3.2.10 灭菌吸管：10 mL（刻度精度 0.1 mL）和 1 mL（刻度精度 0.01 mL） 。 5.3.2.11 灭菌量筒： 容量 100 mL 和 250 mL。 5.3.2.12 灭菌培养皿：直径 90 mm ～100 mm。 5.3.2.13 可调微量移液器或移液管：10 μL～200 μL，50 μL～1 000 μL 及吸头。 5.3.3 病料采集与分离 5.3.3.1 泄殖腔和新鲜粪便拭子 将拭子直接划线接种于选择性培养基平板上后，将平板置于 36 ℃ ±1 ℃培养 24 h，挑取可疑菌落 进行鉴定；同时将划线后的棉拭子置于选择性增菌液中，培养 24 h 和 48 h，转种于选择性琼脂平板 上。琼脂平板经 24 h 培养，直接挑取可疑菌落进行鉴定。 5.3.3.2 胆囊内容物 将胆囊内容物拭子划线于非选择性和选择性琼脂平板上。同时，将拭子分别置于非选择性和选择 性增菌液中，培养 24 h 和 48 h，再划线转种于选择性琼脂平板上。 5.3.3.3 组织器官 将无菌采自个体的病变组织拭子或组织匀浆直接划线接种于非选择性和选择性琼脂平板上。之 后，将划过线的拭子或剩余组织匀浆分别置于非选择性和选择性增菌液中，36 ℃ ±1 ℃培养 24 h 和以正式出版文本为准 SN/T 5184—2020348 h，再划线转种于选择性琼脂平板上。 5.3.3.4 带菌鸡 对于带菌鸡的确诊需要大量的样品材料。分离鸡白痢沙门氏菌宜用卵和输卵管，分离鸡伤寒沙 门氏菌宜用肝脏和胆囊，也可用卵和输卵管。好的分离效果宜从各种组织包括脾脏中采取样品。用少 量肉汤将组织制成匀浆，直接划线于选择性和非选择性琼脂平板上，同时，各取 10 mL 分别接种到 90 mL 非选择性肉汤如缓冲蛋白胨水和 90 mL 选择性肉汤如 SC 中，于 36 ℃ ±1 ℃培养 24 h，再划线 转种于选择性琼脂平板上。 5.3.3.5 消化道包括盲肠扁桃体和肠内容物 在 1 ：10 研磨或匀浆后，各取 10 mL 分别加入到 90 mLSC 和 90 mL TTB 选择性增菌肉汤中，分 别置 36 ℃ ±1 ℃和 42 ℃ ±1 ℃培养 24 h 和 48 h，再划线转种于选择性琼脂平板上。 5.3.3.6 蛋壳 各取 10 g 碎蛋壳，分别加入到 90 mL SC 和 90 mL TTB 选择性增菌肉汤中，分别置于 36 ℃ ±1 ℃ 和 41 ℃ ±1 ℃培养 24 h 和 48 h，再划线转种于选择性琼脂平板上。 5.3.3.7 蛋内容物 无菌采取新鲜鸡蛋的内容物 25 g，加入 225 mL 缓冲蛋白胨水或营养肉汤搅拌匀浆，置 36 ℃ ±1 ℃ 培养 24 h 和 48 h，再划线转种于选择性琼脂平板上。孵过的蛋，不管是否受精或含有小胚胎，都可 作类似处理。 5.3.3.8 鸡胚 将鸡胚制成匀浆，直接划线接种于非选择性和选择性琼脂平板上。同时，分别取 1 g 组织匀浆接 种于 9 mL 非选择性增菌肉汤如缓冲蛋白胨水和选择性增菌肉汤如 SC 中，于 36 ℃ ±1 ℃培养 24 h 和 48 h，再划线转种于非选择性和选择性琼脂平板上。 5.3.3.9 垫料等环境样品 包括粘附在孵化器的绒毛、蛋壳碎片或小鸡排泄物样品、出雏盒垫料、地板上粪便或垃圾样品 等。取 25 g 样品分别加入到 225 mL SC 和 225 mL TTB 中，混合均匀，分别置于 36 ℃ ±1 ℃和 42 ℃ ±1 ℃培养 24 h 和 48 h，再划线转种于选择性琼脂平板上。 5.3.4 病原生化鉴定 先用接种针在平板上挑取 5 个典型或可疑菌落分别接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再穿刺底 层；接种针无需灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶培养基或尿素酶培养基和营养琼脂平板。于 36 ℃ ±1 ℃ 培养 24 h ±2 h。必要时可延长至 48 h ±3 h。沙门氏菌在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶培养基或尿素酶培 养基的反应分别见表 1 和表 2。以正式出版文本为准 SN/T 5184—20204表1 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶培养基内的反应结果 三糖铁琼脂 赖氨酸脱羧酶培养基 初步判断 斜面 底层 产气 硫化氢 K A +（-） +（-） + 可疑沙门氏菌属 K A +（-） +（-） - 可疑沙门氏菌属 A A +（-） +（-） + 可疑沙门氏菌属 A A + / - + / - - 非沙门氏菌 K K + / - + / - + / - 非沙门氏菌 注： K ：产碱；A ：产酸；+ ：阳性；- ：阴性；+（-） ：多数阳性，少数阴性；+ / - ：阳性或阴性。 表 2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和尿素酶培养基内的反应结果 三糖铁琼脂 尿素酶培养基 初步判断 斜面 底层 产气 硫化氢 K