以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5183 —2020 代替 SN/T 1162— 2002 牛皮蝇蛆病检疫技术规范 Quarantine protocol for Bovine hypodermosis 中华人民共和国海关总署 发 布ICS 11.220 CCS B 41 2020 -12-30发布 2021 -07-01 实施以正式出版文本为准以正式出版文本为准I SN/T 5183—2020前 言 本文件按照 GB/T 1.1— 2020 的规定起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国人民共和国乌鲁木齐海关、中华人民共和国 广州海关。 本文件主要起草人：吴绍强、邓俊花、吕继洲、王振宝、王彩霞、袁向芬、张永宁、邓艳、李 霆、梅琳。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5183—2020牛皮蝇蛆病检疫技术规范 1　范围 本文件规定了牛皮蝇蛆病检疫时的临床症状检查、剖检检查和病原形态学鉴定以及酶联免疫吸 附试验（ELISA）等技术规范。 本文件适用于进出境活牛和牛皮张中牛皮蝇蛆的检疫，也适用于牛养殖场牛皮蝇蛆病的流行病 学调查和监测。 2　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法 3　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4　疫病概述 牛皮蝇蛆病（ Bovine hypodermosis ）是由皮蝇科（ Hypodermine ） 、皮蝇属（ Hypoderma ）的牛皮 蝇（ H.bovis ） 、纹皮蝇（ H.lineatum ）和中华皮蝇（ H.sinense ）寄生于牦牛或黄牛体内而引起的一种寄 生虫病。 本病的危害主要表现为牛皮穿孔，肉、奶产量降低且品质下降，感染强度高的可致动物死亡。 牛皮蝇蛆病现已报道的病原分属于 10 属中的 39 种，特异性的宿主为牛属动物的黄牛、牦牛、犏 牛和水牛，但有时也可感染马等其他家畜和人，而且能够发育成熟。鉴于本病对畜牧业的严重危害，世界上许多国家在上世纪二三十年代便启动了皮蝇蛆病控制与扑灭行动，并将消灭皮蝇蛆病立法加以强制执行。皮蝇蛆病流行范围广，在北纬 18° ～60° 范围内的 55 个国家都有本病的流行。我国牛皮蝇 蛆病的地理分布主要在东北、华北、西北等地区的农牧区，这些农牧区的牛皮蝇蛆病尤为严重。在流行区内，感染率达 80% 以上，严重感染地区高达 98% ～100%，特别是 1～3 岁的犊牛易受感染，4 岁 以上牛发病率降低。 5　材料与试剂 除另有规定外，所用化学试剂均为分析纯。试验用水应达到 GB/T 6682 中一级水的要求。 牛皮蝇蛆病抗体检测试剂盒：本标准以商品化试剂盒 Bovine Hypodermosis Antibody Test Kit 为例 进行操作，也可采用经过验证、检测效果确实的其他牛皮蝇蛆病 ELISA 检测试剂盒。以正式出版文本为准2 SN/T 5183—20206　设备 6.1　体视显微镜。 6.2　酶标仪。6.3　-20 ℃普通冰箱、4 ℃冰箱。6.4　高压灭菌锅。6.5　离心管、微量移液器及配套的吸头、玻璃培养皿及解剖针。 6.6　恒温培养箱。 7　临床症状检查7.1　适用范围 适用于进出境隔离检疫期间活牛感染牛皮蝇蛆的检疫。 7.2　临床症状 牛感染皮蝇后，一般不呈现明显的临床症状，但严重感染时，幼畜表现出消瘦、生长缓慢、贫 血，母牛产乳量下降，役畜的使役能力降低等症状。当皮蝇幼虫钻入脑部时，可引起神经症状，如作 后退运动、突然倒地、麻痹或晕厥等，重者可造成死亡。此外，由于第三期幼虫在皮肤上形成穿孔，细菌感染而引起化脓，形成瘘管，常有脓液和浆液流出，瘘管逐渐愈合，形成斑痕。但上述症状只能作为皮蝇感染的参考指标，不能作为确诊的依据。只有当在牛的背部发现瘤肿状隆起和皮下蜂窝组织炎，且可挤出第三期幼虫时，方能确诊。 8　剖检及形态学鉴定 8.1　适用范围 适用于死亡牛的病情确诊，也适用于进出境牛皮张的检疫。 8.2　剖检 重点检查食道黏膜、背部皮下、瘤胃浆膜、大网膜、食道浆膜等部位。三期幼虫引起动物皮肤隆 起似瘤肿物。动物隆起处有小孔，孔周围常见干涸脓痂，孔内结蹄组织囊中可见幼虫。如发现第三期 幼虫，便可确诊。取可疑的牛皮蝇蛆虫体，置于玻璃培养皿内，解剖针辅助翻动虫体，体视显微镜下观察是否具备相关形态学特征。 8.3　形态学鉴定8.3.1　第二期幼虫的形态 呈浅黄白色，长 11 mm ～15 mm，宽 3 mm ～6 mm。腹面微隆，背面平。外观口钩不明显，仅见 两个黄褐色的小圆点，彼此分离。腹面各节前后缘刺分界不明显，气门未形成肾形，似石榴颗粒状， 堆积排列。 8.3.2　第三期幼虫的形态 虫体长 19 mm ～25 mm，宽 8 mm ～11 mm，长宽比例（2.3～2.1） ： 1。背面平，腹面隆起。侧面 有疣状突，色泽因成熟程度不同而异，由淡黄色至淡褐色、黄褐色以至黑色，体具 11 节（胸部 3 节、以正式出版文本为准3 SN/T 5183—2020腹部 8 节） 。伪头部具一对头感器，彼此分离。口钩退化成黑色圆点。腹面最后二节无刺，后气门凹 陷深，呈漏斗状，气门板（孔）的表面有很多粗壮的突棘（参见附录 A） 。 9　酶联免疫吸附试验（ELISA）9.1　适用范围 适用于进出境活牛是否感染牛皮蝇蛆的检测。 9.2　血清样品的采集和处理 颈静脉采集动物血液，分离血清， 4 ℃冷藏保存。 9.3　操作步骤 9.3.1　试剂制备 见附录 B。 9.3.2　包被 采用 Bovine Hypodermosis Antibody Test Kit 中“皮蝇抗原反应板” ，其中，包被抗原为纯化的纹皮 蝇Ⅰ期幼虫提取物。9.3.3　加样 按照表 1 加样。 加入试剂盒中 2 号血清稀释液，每孔 190 μL。 加入待检血清、标准阳性血清及标准阴性血清，每孔 10 μL。 表 1　ELISA 反应板使用样式表 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 APositive controlS7 S15 S23 S31 S39 S45 S53 S61 S69 S77Negative control B S1 S8 S16 S24 S32 S40 S46 S54 S62 S70 S78 S85 C S2 S9 S17 S25 S33 S41 S47 S55 S63 S71 S79 S86 D S3 S10 S18 S26 S34Positive controlS48 S56 S64 S72 S80 S87 E S4 S11 S19 S27 S35Negative controlS49 S57 S65 S73 S81 S88 F S5 S12 S20 S28 S36 S42 S50 S58 S66 S74 S82 S89 G S6 S13 S21 S29 S37 S43 S51 S59 S67 S75 S83 S90 HNegative controlS14 S22 S30 S38 S44 S52 S60 S68 S76 S84Positive control 注 ： S:Sample以正式出版文本为准4 SN/T 5183—20209.3.4　孵育 轻轻混匀后，加盖，37 ℃孵育 1 h。 9.3.5　洗涤 弃孔中液体，加入洗液洗涤，每孔 300 μL，重复洗涤 3 次。 9.3.6　酶标抗体反应 加入辣根过氧化物酶 HRP 标记的抗反刍动物 IgG，每孔 100 μL，加盖，37 ℃孵育 30 min。 9.3.7　二次洗涤 弃孔中液体，加入洗液洗涤，每孔 300 μL，重复洗涤 3 次。 9.3.8　显色 加入底物溶液 TMB 每孔 100 μL，加盖，在 18 ℃ ~26 ℃条件下 , 避光孵育 20 min。 9.3.9　终止反应 加入终止液每孔 100 μL，轻轻混匀，终止反应。 9.3.10　测定 用酶标仪测定 OD450值。 9.4　结果计算 9.4.1　对照 阳性对照平均值（ PCx） 、阴性对照平均值（NCx）, 计算见式（1） 、式（2） 。 PCx= （PC1A450 + PC2A450+ PC3A450） 3 ……………………………（1） NCx= （NC1A450 + NC2A450+ NC3A450） 3 ……………………………（2） 9.4.2　样本 S = （SA450 - NCx） P （ PCx - NCx） ……………………………（3） 9.5　结果判定9.5.1　试验成立判定 PC x ≥ 3.50 NCx 9.5.2　结果判定 在阴阳性对照检测结果有效时进行样品结果判定，判定标准如下： ——阴性：S/P ≤ 45% ；——可疑：45% ＜ S/P ＜ 55% ；