以正式出版文本为准ICS 65.150 B 41 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5181 —2020 金鱼造血器官坏死病检疫技术规范 Quarantine protocol for gold fish haematopoietic necrosis 2020 -12-30发布 2021 -07-01 实施ICS 65.150 CCS B 41 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5181—2020I前 言 本文件按照 GB / T 1.1— 2020 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位： 中华人民共和国深圳海关、深圳市检验检疫科学研究院。本文件主要起草人：贾鹏、王津津、刘莹、于力、郑晓聪、何俊强、刘荭、史秀杰、兰文升。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5181—2020金鱼造血器官坏死病检疫技术规范 1 范围 本文件规定了检测鲤疱疹病毒 2 型的临床症状，检测的器材和设备，试剂和材料，采样，诊断方 法及综合判定。 本文件适用于金鱼造血器官坏死病的诊断、监测和检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB / T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB / T 18088 出入境动物检疫采样 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 术语、定义和缩略语 本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。GFHN（golden fish haematopoietic necrosis） ：金鱼造血器官坏死。CyHV 2（cyprinid herpesvirus 2） ：鲤疱疹病毒 2 型。Ct（cycle threshold） ：循环阈值。CTAB（hexadecyl trimethyl ammonium bromide） ：十六烷基三甲基溴化胺。DNA（deoxyribonucleic acid） ：脱氧核糖核酸。dNTPs（deoxynucleotide triphosphates） ：三磷酸脱氧核糖核苷酸。PCR（polymerase chain reaction） ：聚合酶链式反应。 4 概述 金鱼造血器官坏死病（Gold Fish Haematopoietic Necrosis，GFHN）是由鲤疱疹病毒 2 型（Cyprinid Herpesvirus 2，CyHV 2） 感染金鱼和鲫鱼等鲤科鱼类并引起发病的一种病毒性传染病 （参见附录 A） 。 5　临床症状 金鱼等感染 GFHNV 后，表现为昏睡、食欲不振或废绝，鳃丝发白。濒死鱼可见大量血液从 鳃盖下缘自然溢出，体表充血，腹部肿胀，眼眶基部充血。解剖后，可见肌肉出血，脾肾不同程 度出血，肝脾肿大，鳔点状出血。以正式出版文本为准2 SN/T 5181—20206　器材和设备 6.1　普通冰箱和超低温冰箱。 6.2　制冰机。6.3　无菌组织研磨器。6.4　二级生物安全柜。6.5　冷冻高速离心机。 6.6　PCR 仪。 6.7　水平电泳仪。6.8　凝胶成像仪。6.9　实时荧光 PCR 仪。6.10 　不同规格的微量移液器，量程包括 0.5 μL~10 μL、10 μL~100 μL、100 μL~1 000 μL。 6.11 　高压灭菌器。 6.12 　剪刀、镊子、酒精棉球、离心管和 PCR 管等耗材。 7　试剂和材料 7.1　水：符合 GB / T 6682 中一级水的规格。 7.2　磷酸盐缓冲液（见 B.1） 。7.3　CTAB 溶液（见 B.2） 。7.4　抽提液 1（见 B.3） 。7.5　抽提液 2（见 B.4） 。7.6　无水乙醇，分析纯。7.7　TE 缓冲液（见 B.5） 。7.8　10×PCR 扩增缓冲液（见 B.6） 。7.9　Taq 酶：-20 ℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。 7.10 　dNTPs ：含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各 10 mmol / L。 7.11 　TBE 电泳缓冲液（见 B.7） 。 7.12 　溴乙啶（见 B.8） 。 7.13 　6× 上样缓冲液（见 B.9） 。 7.14 　2× 实时荧光 PCR 预混液（见 B.10） 。 7.15 　PCR 用引物：浓度为 20 μmol/L。 上游引物 JF ：5 ’- GGACTTGCGAAGAGTTTGATTTCTAC-3 ’ 下游引物 JR ：5 ’- CCATAGTCACCATCGTCTCATC-3 ’ 扩增 GFHNV 解螺旋酶基因 366 bp 的片段（参见附录 C.1） 。 7.16 　实时荧光 PCR 用引物和探针：浓度为 10 μmol/L。 上游引物 rtF1 ：5 ’-TCGGTTGGACTCGGTTTGTG-3 ’ 下游引物 rtR1 ：5 ’-CTCGGTCTTGATGCGTTTCTTG-3 ’ 探针：5 ’-FAM-CCGCTTCCAGTCTGGGCCACTACC-BHQ1-3 ’ 扩增 GFHNV DNA 聚合酶基因 92 bp 片段（参见附录 C.2） 。 8　采样 采样对象包括健康的、发病的和濒死的金鱼和鲫鱼等，采样数量按照 GB / T 18088 规定执行，以正式出版文本为准3 SN/T 5181—2020实验室应符合 GB 19489 的规定。 冰浴条件下，每 5 尾 ~10 尾鱼作为一个小样，每个小样至少采集 0.1 g 组织。体长小于 4 cm 的鱼苗取整条鱼；4 cm~6 cm 的鱼苗取所有内脏（含肾脏） ；体长大于 6 cm 的鱼取肾、脾脏、鳃 （用酒精棉球去除鳃表面黏液） 、脑。 9　诊断方法 9.1　PCR 方法 9.1.1　设立对照 从提取样品 DNA 起，均需要设立阳性对照、阴性对照、空白对照。取已知含有 GFHNV 的阳 性组织作为阳性对照；取健康鱼组织作为阴性对照；取等体积的无菌去离子水作为空白对照。9.1.2　核酸抽提（CTAB 法） 无菌条件下，将取得的组织在无菌研钵中进行匀浆，用预冷的磷酸盐缓冲液以 1 : 10 （质量 : 体积） 将组织重悬，4 ℃ 8 000 r / min 离心 5 min，取上清液待检。 取 450 μL 组织悬液加入 1.5 mL 的离心管，加 450 μL CTAB 溶液，充分混匀，25 ℃作用 2.5 h。 向离心管中加 600 μL 抽提液 1， 剧烈振荡混匀 30 s 以上，12 000 r / min 离心 5 min。取上层水相 （约 800 μL）至新的离心管，加 700 μL 抽提液 2， 振荡混匀 30 s，12 000 r / min 离心 5 min。小心 取上层水相（约 600 μL）至新的离心管，加入 1.5 倍体积的预冷无水乙醇（约 900 μL） ，上下颠 倒混匀后，-20 ℃沉淀核酸 2 h 以上。12 000 r / min 离心 30 min，弃上清液。将离心管倒置于吸 水纸上，室温干燥 30 min。向 DNA 沉淀中加 50 μL TE 缓冲液，-20 ℃保存备用。 可使用同等效果的商品化核酸抽提试剂盒代替以上方法。 9.1.3　反应体系 在反应管中加入 10×PCR 扩增缓冲液 5 μL、上下游引物（20 μmol / L）各 1 μL、dNTPs （10 mmol / L）1 μL、Taq 酶（5 U / μL）1 μL，加双蒸水至总体积 50 μL。将反应管瞬时离心后， 置于 PCR 仪。9.1.4　反应条件 94℃预变性 4 min ；94 ℃变性 1 min，60 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 30 s，40 次循环；72 ℃ 再延伸 10 min。9.1.5　琼脂糖凝胶电泳 用 TBE 电泳缓冲液配制 1.5% 的琼脂糖（含 0.5 μg / mL 溴乙啶）凝胶板。将其放入水平电泳槽， 使电泳缓冲液刚盖过胶面。取 5 μL PCR 产物和 1 μL 6×上样缓冲液混匀后加入样品孔，5 V / cm 电泳约 30 min，将凝胶置于凝胶成像仪观察结果。 也可采用同等效果的其他方法，例如毛细管电泳分析仪。 9.1.6　测序 对 PCR 扩增产物进行基因序列测定，并将测序结果与参考序列（参见附录 C）进行同源性比 对，或在 Genbank 中进行序列同源性分析，同源性应大于 98%。9.1.7　结果判定9.1.7.1　被检样品结果的判定均建立在阳性和阴性对照成立的基础之上。阳性对照可扩增出一条以正式出版文本为准4 SN/T 5181—2020大小为 366 bp 的特异性条带。阴性对照和空白对照不能扩增出 366 bp 条带。 9.1.7.2　被检样品未扩增出条带，或者虽有条带但大小不是 366 bp，则判定为 PCR 方法检测结果阴性。若被检样品扩增出大小为 366 bp 的特异性条带，且测序结果与参考序列相符，判定为PCR 方法检测结果阳性。 9.2　实时荧光 PCR 方法 9.2.1　对照设立 见 9.1.1。 9.2.2　核酸抽提 见 9.1.2。 9.2.3　反应体系 2×实时荧光 PCR 预混液 10 μL，上游引物（10 μmol / L）0.5 μL，下游引物（10 μmol / L）0.5 μL， 探针（10