以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5180 —2021 中华人民共和国海关总署 发 布ICS 11. 020 CCS C 62 2021 -06-18发布 2022 -01-01 实施微小病媒生物无损伤制备基因组 DNA 方法 Protocol for obtaining high quality genome DNA from tiny vector without damaging morphology of the vouchers以正式出版文本为准以正式出版文本为准I SN/T 5180—2021前 言 本文件按照 GB/T 1.1— 2020《标准化工作导则　第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国拱北海关、中华人民共和国郑州海关。本文件主要起草人：邱德义、陈健、张勤、魏晓雅、刘德星、李婷婷、岳巧云。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5180—2021微小病媒生物无损伤制备基因组 DNA 方法 1　范围 本文件规定了微小病媒生物的基因组 DNA 制备方法，包含对标本的前处理、消化、裂解、提取、 纯化基因组 DNA 的操作程序。 本文件适用于利用 DNA 条形码等分子生物学技术对微小病媒生物进行种类鉴定或者其他需获取 病媒生物基因组 DNA 的工作。 2　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法GB 19489　实验室　生物安全通用要求SN/T 1876　医学媒介生物标本采集、制作及保存规程SN/T 2752.4　卫生检疫人员的自我防护规范　第 4 部分：实验室人员SN/T 4278　国境口岸医学媒介昆虫 DNA 条形码鉴定操作规程SN/T 4629　检疫性有害生物凭证标本核酸制备、保存与管理规范WS/T 230　临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 3　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1　　　微小病媒生物　tiny vector 体型微小，难以通过部分组织获取足量基因组 DNA 进行后续分子鉴定的病媒生物。常见的种类 有蜱、螨、蚤、虱等。3.2　　　无损伤制备基因组 DNA　obtaining genome DNA without damaging morphology of the vouchers 在提取基因组 DNA 的过程中，对样本外观不造成损害，处理后的样本仍保持外观的完整性和可 识别的形态特征，仍可采用形态学鉴定方法对其进行种类鉴定的基因组 DNA 的制备方法。 4　要求 实验室的生物安全应符合 GB 19489 要求，实验室人员防护应符合 SN/T 2752.4 的要求，实验中用 水应符合 GB/T 6682 的要求，PCR 扩增检测应符合 SN/T 4278 和 WS/T 230 的要求。以正式出版文本为准2 SN/T 5180—20215　仪器设备及试剂耗材 5.1　仪器设备 普通台式离心机（最大相对离心力大于 14 000 g） 、各量程可调移液器（10 μL、20 μL、100 μL、 200 μL、1 000 μL） 、可调式恒温浴、PCR 工作站或者超净工作台、PCR 扩增仪、电泳仪、凝胶成像系 统、冰箱、核酸蛋白浓度测定仪等。 5.2　试剂耗材 分析纯无水乙醇、磷酸缓冲液（0.05 mol/L pH 6.0） 、几丁质酶、蛋白酶 K、动物组织基因组 DNA 提取试剂或试剂盒、琼脂糖、DNA 标准分子量标、双蒸水（ddH2O） 、硫氰酸胍（GuSCN） 、乙二胺四 乙酸（EDTA） （0.5 mol/L pH 8.0） 、三羟甲基氨基甲烷（Tris -HCL） （1 mol/L pH 8.0） 、聚乙二醇辛基苯 基醚（Triton X -100） 、吐温 20（Tween -20）等。 离心管（1.5 mL） 、PCR 管（0.2 mL） 、各量程的移液器吸头（10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、 1 000 μL） 、一次性无粉手套等。 6　操作程序 6.1　样本前处理 将收集的样本用 90% 的乙醇保存，或者将活标本放置于 -80 ℃冰箱中冷冻处死并临时保存。取 单个微小病媒生物标本置于灭菌的 1.5 mL 离心管中，加入 0.5 mL ddH2O，低速旋涡振荡 30 s，清洗 表面杂质或残余的乙醇，清洗 3 遍，吸净溶液后将样本放置在生物安全柜中晾干 15 min。 6.2　样本的消化 对硬蜱、蚤等具有较厚几丁质外壳的微小病媒生物，将晾干的单个样本置于灭菌的 1.5 mL 离心 管中，加入 20 μL 浓度为 1.00 mg/mL 的几丁质酶磷酸缓冲液 （pH 6.0） ，25 ℃金属浴中消化 24 h。 对螨、 虱等几丁质外壳较薄的微小病媒生物则略过此步骤。6.3　样本的裂解 将上述用几丁质酶处理过的样品取出，放入灭菌的 1.5 mL 离心管中，加入 20 μL 裂解液（见附 录 A）和 20 μL 浓度为 20 mg/mL 的蛋白酶 K，混合均匀， 55 ℃ 裂解过夜。收集裂解后的溶液备用， 提取基因组 DNA。6.4　标本的制作和保存 裂解处理后的标本，按照 SN/T 1876 和 SN/T 4278 确定的要求进行标本制作和保存。 6.5　提取基因组 DNA 裂解后的溶液按动物组织 DNA 酚三氯甲烷法（见附录 B）或用动物组织基因组 DNA 提取试剂盒 进行基因组 DNA 的提取、纯化。以正式出版文本为准3 SN/T 5180—20217　DNA 提取质量的判定和保存 7.1　紫外分光光度法检测 DNA 浓度和纯度 以溶解 DNA 的溶液做参比，分别测定样品溶液在 260 nm、280 nm、230 nm、270 nm 处的吸收值， 计算 A260/A280、A260/A230、A260/A270的值，同时满足以下条件的 DNA 样品可视为质量高的基因组 DNA ： A260/A280为 1.8～1.9，A260/A230＞ 2.0，A260/A270为 1.1～1.3。 参照 A260=1 相当于 50 μg/mL 的双链 DNA 计算提取 DNA 的浓度，最终要求提取的基因组 DNA 浓 度大于 20 ng/ μL。 若未达到要求的浓度，可依据自身实验条件重新提取，或使用冷冻干燥机或样品浓缩仪进行 浓缩。 7.2　基因组 DNA 的保存 提取纯化的 DNA 样品置于 -20 ℃冰箱中保存备用，基因组 DNA 不宜反复冻融，建议将所得 DNA 进行分装保存于 -20 ℃冰箱中，使用时取出，冰浴融化备用；使用后剩余的 DNA 可放于 4 ℃冰 箱短期保存，时间不宜超过 14 d。如果需要长期保存，按照 SN/T 4629 确定的要求进行操作。以正式出版文本为准4 SN/T 5180—2021附　录　A （规范性） 裂解液的配制 A.1　裂解液的配制 A.1.1　试剂 GuSCN（硫氰酸胍） 16.5 g 0.5 mol/L EDTA（乙二胺四乙酸） ，pH 8.0 12 mL 1 mol/L Tris -HCL（三羟甲基氨基甲烷） ，pH 8.0 6 mL Triton X -100（聚乙二醇辛基苯基醚） 1 mL Tween -20（吐温 20） 10 mL A.1.2　配制 将所有的试剂加入到烧杯中，加入 180 mL 的去离子水，使用加热磁力搅拌器充分搅拌溶解、混 匀。用去离子水定容至 200 mL，室温保存备用。 A.2　裂解液各成分的工作浓度 裂解液各成分的工作浓度见表 A.1。 表 A.1　裂解液各成分的工作浓度 成分 浓度 备注 GuSCN 700 mmol/L — EDTA 30 mmol/L pH 8.0 Tris-HCL 30 mmol/L pH 8.0 Triton X -100 0.5% — Tween -20 5% —