以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5179 —2021 中华人民共和国海关总署 发 布ICS 11. 020 CCS C 62 2021 -06-18发布 2022 -01-01实施二代测序法检测蜚蠊携带细菌性样品 制备方法 Protocol for sample preparation of cockroach-borne bacteria detection with next-generation sequencing以正式出版文本为准以正式出版文本为准I SN/T 5179—2021前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国拱北海关。本文件主要起草人：陈健、邱德义、刘恭源、魏晓雅、刘德星、李婷婷、岳巧云。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5179—2021二代测序法检测蜚蠊携带细菌性样品 制备方法 1　范围 本文件规定了蜚蠊携带细菌性样品进行二代测序检测的样本采集、前处理、体内外携带细菌的 收集及基因组 DNA 的获取和扩增等操作程序。 本文件适用于利用二代测序技术对本底调查或口岸截获的蜚蠊携带未知细菌进行高通量检测鉴 定的样品制备工作。 2　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用 文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本文件。 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法GB 19489　实验室　生物安全通用要求SN/T 2752.4　卫生检疫人员的自我防护规范　第 4 部分：实验室人员SN/T 4278—2015　国境口岸医学媒介昆虫 DNA 条形码鉴定操作规程WS/T 230　临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 3　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1　 　　引物标记　primer marker 在常规引物 5' 端加入的一段 6～ 12 个随机设计的碱基序列，用于标记并区分特定样品的扩增反应。 3.2 　　标签引物　labeled primer 由引物标记加常规引物两部分构成，每一个样品进行 PCR 扩增时需保证使用的一对引物中，至 少有一条与其他样品使用的引物标记不同。3.3　　高成功率PCR酶　high success rate PCR polymerase 可成功扩增普通 Taq DNA 聚合酶难以扩增样品的一类新型 DNA 聚合酶。针对含多种 PCR 扩增抑 制物质的粗样品，该酶具有优良的延伸性。常见的有 KOD　FX 系列等。 4　要求 实验室的生物安全应符合 GB 19489 要求，实验室人员防护应符合 SN/T 2752.4 要求，实验中用水以正式出版文本为准2 SN/T 5179—2021应符合 GB/T 6682 要求，PCR 扩增检测应符合 WS/T 230、SN/T 4278 要求。 进行样本携带细菌的收集处理前，应先完成蜚蠊种类的鉴定。 5　仪器设备及试剂耗材 5.1　仪器设备 普通台式离心机（最大相对离心力大于 14 000 g） 、各量程可调移液器（10 μL、20 μL、100 μL、 200 μL、1 000 μL） 、可调式恒温浴、PCR 工作站或者超净工作台、PCR 扩增仪、电泳仪、凝胶成像系 统、冰箱、超低温冰箱等。 5.2　试剂耗材 分析纯无水乙醇、0.9% NaCl 溶液、高成功率 PCR 酶、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP） 、PCR 反应 缓冲液、琼脂糖、DNA 标准分子量标、核酸染料、TAE 电泳液、双蒸水（ddH2O）等。 离心管（10 mL、1.5 mL） 、PCR 管（0.2 mL） 、各量程的移液器吸头（10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL） 、一次性无粉手套等。 6　蜚蠊的采集、保存和运输 将每只蜚蠊标本单独分装在灭菌的采集管或者 50 mL 的离心管中。使用冷藏运输箱（-20 ℃或更 低温度）转运样品。样品送达实验室后，待测样本可放置于 -80 ℃冰箱中冷冻 30 min。用于转移和处 理标本的镊子和离心管等器械和耗材均需高压灭菌，不易高温、高压灭菌的用 75 % 乙醇擦拭灭菌。 7　操作程序7.1　体表携带细菌的收集 取 1 只蜚蠊置于 10 mL 离心管中，加入 3 mL 生理盐水，800 r/min 旋涡振荡 30 s，短暂离心。收集 上清液转移至新的 10 mL 离心管中，13 800 g离心 2 min。弃上清液，留沉淀。重复以上步骤 3 次。将 收集的细菌沉淀物，加入 500 μL 生理盐水悬浮后合并，4 ℃保存备用。 收集废弃液高压灭菌后丢弃。 7.2　体内携带细菌的收集 将 7.1 处理后的蜚蠊移入 10 mL 的灭菌离心管中，加入 5 mL 75% 乙醇浸泡 5 min，重复 3 次；将蜚 蠊转移至新的 10 mL 的灭菌离心管中，然后加入 5 mL 0.9% NaCl 溶液，800 r/min 旋涡振荡 30 s，弃上 清液，以上步骤重复 3 次。 将样本放置在生物安全柜中晾干 15 min。用灭菌镊子将样本移入新的 10 mL 离心管中，将标本研 碎成糊状。 加入 3 mL 生理盐水，800 r/min 旋涡振荡 30 s，短暂离心，将上清液转移至新的 10 mL 离心管中， 13 800 g 离心 2 min，弃上清液，留沉淀。重复以上收集步骤 3 次，将收集的细菌沉淀物，加入 500 μL 生理盐水悬浮后合并，4 ℃保存备用。 收集废弃液高压灭菌后丢弃。 7.3　细菌基因组DNA的提取 将装有菌液的离心管 13 800 g 离心 2 min，转移上清液并高压灭菌处理。收集的细菌使用细菌基 因组 DNA 提取试剂盒（含溶菌酶消化）或使用核酸自动提取仪提取细菌基因组 DNA，提取的基因组以正式出版文本为准3 SN/T 5179—2021DNA 保存在 4 ℃冰箱作为模板 DNA 备用。 7.4　PCR扩增7.4.1　引物 不同测序公司使用的引物标记不同。引物标记可咨询测序公司获得，也可自行设计，在测序时 需将自行设计的引物标记告知测序公司。 标签引物： —— 引物标记 + 5 ′ -ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′ ——引物标记 + 5 ′ -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′ 7.4.2　PCR扩增体系 PCR 扩增体系见表 1。 表1　PCR扩增体系（50 μL） 组分名称 体积 / μL 缓冲液（2×） 25 dNTP（2 mmol/L） 2.5 高成功率 PCR 酶（1 U/ μL） 1 正向引物（20 μmol/L） 1 反向引物（20 μmol/L） 1 模板 DNA 3 ddH2O 16.5 7.4.3　PCR扩增条件 94 ℃预变性 2 min；98 ℃变性 10 s，50 ℃退火 30 s，68 ℃延伸 30 s，30 个循环；68 ℃延伸 10 min；10 ℃保温。 7.5　PCR产物检测和纯化 参见 SN/T 4278—2015 中 7.4 和 7.5 规定执行操作。 7.6　PCR产物浓度测定 使用 DNA 浓度测定仪对 PCR 产物浓度和质量进行检测，以 DNA 溶解溶液做参比，分别测定样品 溶液在 260 nm、280 nm、230 nm、270 nm 处的吸收值，计算 A260/A280、A260/A230、A260/A270的值，同时 满足以下条件的 DNA 样品可视为质量高的基因组 DNA：A260/A280为 1.8～1.9，A260/A230大于 2.0，A260/ A270为 1.1～1.3。 利用 A260=1 相当于 50 μg/mL 的双链 DNA 计算 DNA 浓度，要求 PCR 产物的 DNA 总量大于等于 2 μg，浓度大于等于 50 ng/ μL。 8　PCR产物样品的寄送 根据测序公司提供的表格模板，填写 DNA 样品信息单，使用干冰冷冻 PCR 产物邮寄至测序公司 进行测序，并明确标注寄送样品为 PCR 产物和片段大小。送样前需与测序公司联系，若其有其他送 样要求，应符合该测序公司要求。以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫 开本 880×1230 1/16 印张 0.5 字数 12 千字 2021 年 7 月第一版 2021 年 7 月第一次印刷 印数 1—500 书号：155175·108 定价 16.00 元二代测序法检测蜚蠊携带细菌性样品 制备方法行 业 标 准 SN/T 5179—2021 * * * SN/T 5179 —2021 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号 （100023） 编辑部：（010）65194242-7531 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷中国海关出版社有限公司出版发行 网址 www.customskb.com/book