以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5178 —2021 按蚊属分子鉴定方法 Molecular identification for genus AnophelesICS 11.020 CCS C 62 2021 -06-18发布 2022 -01-01 实施 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准I SN/T 5178—2021前 言 本文件按照 GB/T 1.1— 2020《标准化工作导则　第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国南京海关、中华人民共和国福州海关、中华人民共和国北京 海关、中国检验检疫科学研究院。 本文件主要起草人：杨庆贵、何江、朱军、吴瑜凡、孙立新、张建庆、郭惠琳、黄恩炯、胡双双、 聂国嫒、袁大炜、郭天宇、陆永昌。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5178—2021按蚊属分子鉴定方法 1　范围 本文件规定了按蚊 （ Anopheles Meigen,1818） 成虫 （包括肢体残缺不全的成虫） 及蛹、幼虫、卵的。 本文件适用于按蚊属分子的鉴定。 2　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件，不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法GB 19489　实验室 生物安全通用要求SN/T 1876　医学媒介生物标本采集、制作及保存规程SN/T 2752.4　卫生检疫人员的自我防护规范　第 4 部分：实验室人员SN/T 4278　国境口岸医学媒介昆虫 DNA 条形码鉴定操作规程SN/T 4629　检疫性有害生物凭证标本核酸制备、保存与管理规范WS/T 230　临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 3　术语和定义 SN/T 4629 和 SN/T 4278 界定的术语和定义适用于本文件。 4　原理 利用 BOLD 中规定的通用引物对线粒体 DNA 中的 COI 基因的特定片段进行扩增，PCR 产物克隆 或者直接测序后，得到长度不少于 500 bp 的有效序列，跟 BOLD 系统中的数据进行比对，从而达到物种快速准确鉴定的目的。 5　引物 LCO1490 5 ’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3 ’ HCO2198 5 ’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3 ’ 6　鉴定程序6.1　准备 实验室需具备的设备和试剂见附录 A，实验室生物安全应符合 GB 19489（所有部分）中的规定， 人员防护应符合 SN/T 2752.4（所有部分） 中的的规定；PCR 防污染措施应按照 WS/T 230 确定的执行。以正式出版文本为准2 SN/T 5178—20216.2　标本的处理 6.2.1　取样 对所检测的标本进行唯一性标示。新鲜标本（包括卵、幼虫、蛹及成虫）及时冷冻或者毒瓶处死 后，投入大于 90 % （体积分数） 的酒精固定；截获的干燥标本和死标本直接投入大于 90 % （体积分数） 的乙醇溶液固定。取样时，尽量减小组织块的体积，尽可能完整地保持凭证标本的形态特征，尤其是 具有重要分类意义的形态特征。 6.2.2　凭证标本的制作 将采集或截获的按蚊制成标本，再将取样后的标本作为凭证标本，标本的制作和保存参照 SN/T 1876 执行。6.3　基因组 DNA 的抽提 6.3.1　样本的处理 取成蚊的 1 只腿、1 只蛹或 1 头幼虫或者 1 只卵，置于无 DNA 的洁净 1.5 mL 离心管中研磨至粉 末状或者糜状，根据实验室实际情况，选择试剂盒法或者酚 / 三氯甲烷法抽提 DNA。提取时应设置空 白对照。 6.3.2　DNA 提取方法 6.3.2.1　试剂盒法 按动物组织基因组 DNA 提取试剂盒的操作指导书进行基因组 DNA 的抽提。 6.3.2.2　饱和酚 / 三氯甲烷法 细胞裂解后离心分离含核酸的水相，加入等体积的饱和酚溶液，14000 g离心 5 min，转移上清 液至一新的离心管；加入等体积的饱和酚溶液、三氯甲烷、异戊醇 (25:24:1)，14000 g离心 5 min，转 移上清液至一新的离心管；加入等体积的饱和酚，14000 g离心 5 min，转移上清液至一新的离心管； 加入 2 倍体积的无水乙醇，14000 g离心 5 min，弃上清；加入 500 μL 的 70 % 乙醇，14000 g离心 1 min，弃上清，重复该步骤一次；室温或者 37 ℃彻底干燥离心管，加入 50 μL 经高压灭菌的 ddH 2O溶 解 DNA ；提取的 DNA 保存在 4 ℃备用，长期保存应 -20 ℃以下冷冻保存。 6.4　PCR 扩增6.4.1　PCR 扩增体系 根据实际情况，可以选择 50 μL 体系，或者 25 μL 体系。为了验证 PCR 体系有无污染，应同时设 置空白对照和阴性对照。为了验证 PCR 反应是否正常，需要设置阳性对照。 50 μL 体系见表 1。 表 1　扩增体系 组分名称 体积 /μL 缓冲液（10×） 5 dNTP（2.5 mmol/L/each） 2以正式出版文本为准3 SN/T 5178—2021组分名称 体积 /μL 正向引物（20 μmol/L） 1 反向引物（20 μmol/L） 1 Taq DNA 聚合酶（5 U/ μL） 0.5 模板 (50 ng/ μL～100 ng/ μL) 3 ddH2O 37.5 25 μL 体系各组分用量是 50 μL 体系的一半。 6.4.2　PCR 扩增条件 94 ℃预变性 3 min ；94 ℃变性 30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，运行 29 个循环；72 ℃延 伸 10 min。 6.5　PCR 产物的检测 用 1×TAE 缓冲液配成 1 % 的琼脂糖凝胶，检测是否有 PCR 产物及产物的质量，具体见附录 B。 6.6　PCR 产物的纯化 如需要纯化，选用胶孔大的梳子，重新制胶、电泳，将目的片段连胶一起割下，按 PCR 产物纯 化试剂盒的操作指导书进行 PCR 产物的纯化。也可根据实际情况，委托测序公司进行纯化。 6.7　PCR 纯化产物的测序 委托专业的测序公司进行 PCR 产物的直接测序，按照所选公司的特定要求进行送样。要求两端 测序或测通。有条件的实验室可以选择克隆测序，克隆的流程见附录 C。6.8　序列的分析和比对 比对序列时，引物序列不包含在内。与 BOLD 系统（www.barcodinglife.com）中的数据进行比对， 比对流程见附录 D。各按蚊的 DNA 序列见附录 E。 7　结果判定 BOLD 系统给出的序列相似度大于等于 99.0 % 者，直接鉴定为查询结果所显示的种类；序列相 似度小于 99.0 % 大于 98.0 % 者，需参考形态学特征进行综合判断，结论可做参考；序列相似度小于 等于 98.0 % 者，不作为结论进行种类判断。表1 （续）以正式出版文本为准4 SN/T 5178—2021附　录　A （规范性） 主要设备和试剂 A.1　仪器和用具 普通台式离心机（相对离心力大于 14 000 g） 、各量程（2 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、 1 000 μL）可调移液器、可调式恒温浴、PCR 工作站或者超净工作台、PCR 扩增仪、电泳仪、凝胶成 像系统、冰箱。 A.2　试剂和材料A.2.1　试剂 除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。 乙醇、动物组织基因组 DNA 提取试剂盒、 Taq酶、dNTP、PCR 产物纯化试剂盒、琼脂糖、DNA 标准分子量标、上样缓冲液、核酸染料、TAE 电泳液。 使用饱和酚 / 三氯甲烷法提取 DNA 需要饱和酚、三氯甲烷、异戊醇等试剂。 A.2.2　水 应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。用于 PCR 的水要使用高温高压灭菌的超纯水。 A.2.3　耗材 1.5 mL 离心管、0.2 mL PCR 管、各量程的移液器 TIPS、无粉一次性手套。