以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5177 —2021 中华人民共和国海关总署 发 布ICS 11. 020 CCS C 62 2021 -06-18发布 2022 -01-01 实施国境口岸寨卡病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法 Real-time RT-PCR method for detecting Zika Virus at frontier ports以正式出版文本为准以正式出版文本为准I SN/T 5177—2021前 言 本文件按照 GB/T 1.1— 2020《标准化工作导则　第一部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、杭州富集生物科技有限公司。 本文件主要起草人：刘丽娟、王静、张晓龙、慈颖、马爱敏、曹晓梅、杨宇、张丽萍、胡孔新。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5177—2021国境口岸寨卡病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法 1　范围 本文件规定了国境口岸寨卡病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法的生物安全要求，样本的采集、运 输、寨卡病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法和现场快速检测方法。 本文件适用于国境口岸入出境人员疑似寨卡病毒的核酸检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）租 用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求WS/T 230 临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫生部　卫科教发〔2006〕15 号）可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（中华人民共和国卫生部令第 45 号） 3　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1　寨卡病毒 Zika virus 一种黄病毒科黄病毒属病毒，呈球形，直径约为 40 nm～ 70 nm，有包膜。基因组为单股正链 RNA， 长度为 10.8 Kb，分为亚洲型和非洲型。寨卡病毒抵抗力不详，但黄病毒属病毒一般不耐酸、不耐热， 60 ℃ 30 min 可灭活，70％乙醇、0.5％次氯酸钠、脂溶剂、过氧乙酸等消毒剂及紫外照射均可灭活。 3.2　逆转录聚合酶链反应 reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR 将 RNA 的逆转录（RT）和 cDNA 的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。本标准采用一步法 逆转录聚合酶链式反应 （RT-PCR） 。 在一步法 RT-PCR 中，首先以 RNA 为模板，利用下游特异性引物， 在依赖 RNA 的 DNA 聚合酶 （逆转录酶） 的作用下转录合成互补 DNA （cDNA） ，该步骤称作 “逆转录” ；随后，再以 cDNA 为模板，利用上游和下游特异性引物，在 DNA 聚合酶的作用下进行 PCR 循环扩增；最终使 RNA 分子的某个特定区域（目的片段）被扩增达几百万倍。 3.3　实时荧光 RT-PCR real-time fluorescence RT-PCR 在常规 RT-PCR 的基础上，加入一条特异性的荧光探针。该探针为一段寡聚核苷酸，两端分别 标记 1 个荧光报告基团和 1 个荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收； PCR 扩增时，利用 Taq 酶的 5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号。以正式出版文本为准2 SN/T 5177—20213.4　快速检测方法 Rapid detection method 不需样本前处理、核酸提取、纯化等步骤，采用商品化的通用型一步法核酸 （RNA） 检测试剂盒， 加入检测样本、寨卡病毒特异性引物和探针进行检测，实现将临床样本直接加到反应体系中进行实时 荧光 PCR 检测的全过程。 4　缩略语 下列缩略语适用于本文件： —— bp ：碱基对（base pair） —— Ct 值 : 每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数（Cycle threshold）—— DEPC ：焦碳酸乙二酯（diethyl pyrocarbonate）—— FAM ：6- 羧基－荧光素（6-carboxy-fluorescein） 5　检测对象 5.1　国境口岸发现的入出境人群中疑似寨卡病毒感染者。 5.2　其他申请检验的人员。 6　生物安全和 PCR 防污染要求 按照 GB 19489 和《人间感染的病原微生物名录》确定的要求，寨卡病毒相关材料的生物安全要 求如下： ——寨卡病毒危害程度分类为第三类； ——未经培养的寨卡病毒感染性材料的操作应该在生物安全二级（BSL-2）实验室内进行；——寨卡病毒相关的灭活材料和无感染性材料操作可在生物安全一级（BSL-1）实验室内进行；——寨卡病毒感染性材料运输和包装分为 B 类，UN 编号为 UN 3373 ；PCR 防污染措施按照 WS/T 230 确定的规定执行。 7　主要仪器 主要仪器设备如下：——荧光定量 PCR 仪，如 ABI 荧光定量 PCR 仪或卡尤迪 Mini8 Plus 实时荧光定量 PCR 仪 1）； ——高压灭菌器； ——二级生物安全柜；—— -70 ℃超低温冰箱（或液氮罐） ；——台式高速低温离心机；——漩涡振荡器；——微量移液器。 1） 　由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产 品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。以正式出版文本为准3 SN/T 5177—20218　主要试剂 主要试剂如下： —— DEPC 水；—— RNA 提取试剂盒：如 QIAamp Viral RNA kit 1）； ——一步法实时荧光 RT-PCR 试剂盒：如 Ag-Path-IDTM one step RT-PCR kit1）； ——一步法核酸（RNA）检测试剂盒：如 Coyote 一步法核酸检测检测试剂盒1）； ——引物和探针：序列见表 1。 表 1　引物和探针序列 引物 / 探针名称 序列（5’-3’ ） 扩增片段 F CGCTAAGTTTGCATGCTCCAAGA 扩增片段为 124 bp R TCATGTCCTGTGTCATTAAC Probe FAM- ACCGGATAATGCTGTCAGTTCATGGCT -BHQ1 注： 探针 5’端标记 FAM 荧光报告基团，3’标记 BHQ1 荧光淬灭基团。其他等效荧光标记物和淬灭基团或等效 　 的引物和探针或其他等效的商品化检测试剂盒也可使用。 9　检验程序 9.1　样本采集 9.1.1　 唾液样本采集：先用清水漱口，静息 5 min ～10 min，弃去最初分泌物的唾液，将继续分泌的唾 液收集于洁净的容器内，至少 3 mL。若液量不足，可嘱其做口舌运动，促进分泌。 9.1.2　 血液样本采集：用无菌真空干燥管，采集患者双份全血或 EDTA 抗凝血至少 5 mL，及时分离血 清或血浆，分装后保存于带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内，标记清楚后低温保存，其中 1 管用于现场 实验室检测，1 管用于上级实验室复核检测。9.1.3　尿液样本采集：以无菌容器收集受检者中段尿液待检 5 mL～ 10 mL。 9.2　实验室检验 9.2.1　样本处理9.2.1.1　唾液样本前处理 采集的唾液样本经 4 000 r/min 离心 15 min 去沉淀，取上清液分装，每份 1 mL，用耐低温油性记 号笔记上编号，保存于带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内后保存，备用。9.2.1.2　血液样本前处理 采集的血液样本，室温下自然放置 1 h～ 2 h，待血液凝固、血块收缩，或用 1 500 r/min～ 3 000 r/min 离心 15 min，吸出血清或血浆，分装后用耐低温油性记号笔记上编号，置于冻存管中备用。现场快速 检测时使用刚采集的全血即可检测。 1） 　由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产 品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。以正式出版文本为准4 SN/T 5177—20219.2.1.3　尿液样本的前处理 采集的尿液标本 2 000 r/min 离心 5 min 去沉淀，将上清液分装至无菌 15 mL 离心管中，每份 5 mL，用耐低温油性记号笔记上编号，置于合适的容器中备用。 9.2.2　病毒核酸提取 参照商品化 RNA 核酸提取试剂盒说明书进行。 9.2.3　实时荧光 RT-PCR 检测9.2.3.1　引物和探针 引物和探针应用液浓度配制成 10 μmol/L，扩增片段大小 124 bp。探针 5’和 3’端分别用 FAM 和 BHQ1 标记。9.2.3.2　阳性对照和空白对照设置 检测过程中分别设阳性对照和空白对照。阳性对照为寨卡病毒 RNA，空白对照用灭菌双蒸水。 9.2.3.3　反应体系组成 表 2　寨卡病毒实时荧光 RT-PCR 的反应体系 成分 体积 RNase-free ddH2O 4.5 μL 2×RT-PCR Buffer 12.5 μL 10 mM Primer F 1 μL 10 mM Primer R 1 μL 10 mM probe 0.5 μL Enzyme Mix 0.5 μL 模板 RNA/ 阴性对照 / 阳性对照 5 μL