以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5175 —2021 国境口岸蚊类 DNA 条形码鉴定规程 Identification codes for mosquitos with DNA barcoding at frontier portsICS 11.020 CCS C 62 2021 -06-18发布 2022 -01-01 实施 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准I SN/T 5175—2021前 言 本文件按照 GB/T 1.1— 2020《标准化工作导则　第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国福州海关。本文件起草人：高 博、方义亮、张建庆、王宇平、黄恩炯。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5175—2021国境口岸蚊类 DNA 条形码鉴定规程 1　范围 本文件规定了国境口岸蚊类 DNA 条形码鉴定方法中 DNA 提取、基因的扩增及序列的比对分析、 结果判定等。 本文件适用于国境口岸蚊类中成虫、幼虫、蛹、残肢不全等标本的 DNA 条形码鉴定。 2　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件，不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB 19489　实验室生物安全通用要求SN/T 1876　医学媒介生物标本采集、制作及保存规程。SN/T 2752.4　卫生检疫人员的自我防护规范第 4 部分：实验室人员SN/T 4278　国境口岸医学媒介昆虫 DNA 条形码鉴定操作规程WS/T 230　临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 3　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1　 ITS2 基因　　 ITS2 gene ITS2 基因核糖体内转录间隔区 2，变异速度适中，能够提供较丰富的变异位点和信息位点，位于 5.8 S 与 28 S 之间，可应用于种团、复合体之间进行鉴定。 4　方法原理 基于线粒体 COI 基因序列对蚊类进行鉴定，确定种内差异、种间差异，结合核糖体 ITS2 基因对 种团、复合组进行鉴定。5　仪器设备、试剂与实验准备5.1　仪器设备 生物安全柜、高压灭菌锅、离心机、微量分光光度仪、PCR 仪、电泳设备、凝胶成像系统等。 5.2　主要试剂 动物组织基因组 DNA 提取试剂盒、PCR Premix、超纯水、DNA 标准分子量标（DL2000）以正式出版文本为准2 SN/T 5175—20215.3　实验准备 实验室生物安全符合 GB 19489 和 SN/T 2752.4 的规定；PCR 防污染措施遵照 WS/T 230 的要求 执行。 6　鉴定方法 6.1　取样 标本样品经过冷冻或乙醚麻醉，死后取成批同种样品的单份标本、珍稀单份标本取对称一侧组 织（如单侧蚊足）置于灭菌的洁净 1.5 mL 离心管留用，如长期不用需放置体积分数为 90% 以上乙 醇 -20℃保存。标本的其它同种个体或者部分针插作为凭证标本。 6.2　凭证标本制作 将取样后的标本制作成凭证标本，标本的制作按照 SN/T 1876 的要求执行。 6.3　DNA 制备 将单份样品（成虫、幼虫、蛹）置于已灭菌的洁净 1.5 mL 离心管后用研磨棒研磨，利用商品化 昆虫 DNA 提取试剂盒进行蚊虫基因组提取（样品为单只蚊的，需去掉头部后（如有吸血的需要去腹 部）后再研磨） ；样品为少量对称一侧组织（单侧蚊足）置于己灭菌的洁净 1.5 mL 离心管后用研磨棒研磨，利用微量组织 DAN 提取方法（见附录 A）进行蚊虫基因组的制备，制备好的 DNA 进行浓度及纯度测定后，保存至 -20℃冰箱备用。 6.4　 COI序列扩增 利用通用引物进行 COI 序列扩增（见附录 B） 、测序，测序结果在中国检疫性有害生物 DNA 条形 码鉴定系统中进行比对（见附录 C） 。6.5　 ITS2 序列扩增 根据序列 COI 结果判定困难的，同时属于蚊类种团、复合组目录（见附录 D）中的蚊种可以通 过ITS2 通用引物进行扩增（见附录 E） 、测序，测序结果在中国检疫性有害生物 DNA 条形码鉴定系 统中进行比对（见附录 C） 。6.6　结果判定 COI 序列长度电泳条带在 750 bp 左右，ITS2 序列长度电泳条带在 500 bp 左右，在中国检疫性有 害生物 DNA 条形码系统进行比对，若与数据库中蚊种序列同源性大于等于 98%，则判定该蚊种和数 据库中的蚊种为同一种。也可以在 BOLD、NCBI 比对，具体按 SN/T 4278 规定执行。 6.7　样本保藏 对同一批中相同形态特征的蚊种数量较多情况下，除了作为核酸提取的标本外，其它根据 SN/T 1876 进行标本制作和保存，提取后核酸和扩增产物除一部分送测序外，剩下的分别做好标记并保存 于 -80℃超低温冰箱作为凭证样本，以便复核。以正式出版文本为准3 SN/T 5175—2021附　录　A （资料性） 微量组织 DNA 提取方法 A.1　配置裂解液 配置 100 mL 裂解液（10 mmol/L Tris-HCl　pH 8.0，1 mmol/L EDTA，1% Nonidet P-40，100 u g/ mL 蛋白酶 K） A.2　热裂解 吸取 35 μ L 儿裂解液，加样匀浆，加 35μ L ddH20，煮沸 5 min。A.3　离心10000 r/min 离心 10 min，取上清备用。以正式出版文本为准4 SN/T 5175—2021附　录　B （规范性） COI序列扩增流程 B.1　引物序列 LCO1490:5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3' HCO2198:5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'B.2　PCR 体系推荐用 50 μ L 体系，引物浓度为 10 μ M，模板可用提取的蚊虫 DNA 10 ～ 100 ng，可用商品化的 PCR mix。 B.3　扩增程序第一步：94℃　5 min;第二步：95℃　30 s，46℃ 30 s，72℃ 40 s，35 个循环：第三步：72℃　7 min。B.4　电泳及测序5 μ L PCR 产物，质量浓度为 1.5% 琼脂糖，PCR 产物大小：约 750 bp。测序引物为 LCO1490 或 HCO2198，双向测序。