以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5174—2021 国境口岸蜱传立克次体实时荧光 PCR 检测方法 Real-time fluorescence PCR detection method for tick-borne Rickettsia at frontier ports ICS 11.020 CCS C 62 2021-06-18 发布 2022-01-01 实施 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准I SN / T 5174—2021前 言 本文件依据 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 本文件由中华人民共和国海关部署提出并归口。 本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京海关、深圳市检验检疫科学 研究院。 本文件主要起草人：杨宇、柏亚铎、曹姗姗、王静、聂聪、赵婷婷、王建成、史蕾。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN / T 5174—2021国境口岸蜱传立克次体实时荧光 PCR 检测方法 1 范围 本文件规定了国境口岸蜱传立克次体检测的生物安全要求，标本的采集、运输和保存，标本的 处理，立克次体实时荧光 PCR 检测方法。 本文件适用于国境口岸入出境人员或媒介蜱携带的立克次体的实时荧光 PCR 检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求SN/T 1293 国境口岸蜱类监测规程WS/T 230 临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫生部 卫科教发〔2006〕15 号） 可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（中华人民共和国卫生部令第 45 号） 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 蜱传立克次体 tick-borne Rickettsia 立克次体 (Rickettsia )是原核细胞型、微小短杆或球杆状多形态、革兰染色阴性的专性细胞内繁 殖的微生物。属立克次体目 (Rickettsiales) 立克次体科 (Rickettsiaceae) 立克次体属 (Rickettsia )。对人 类有致病性的立克次体迄今已经约有 20余种，蜱传立克次体病 (Tick-borne Rickettsia diseases) 是世界 范围内严重威胁人和动物健康的自然疫源性疾病。 3.2 实时荧光 PCR real-time fluorescence PCR 实时荧光 PCR 方法是在常规 PCR 的基础上，加入一条特异性的荧光探针。该探针为一段寡核苷 酸，两端分别标记一个报告基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭 基团吸收；PCR 扩增时，利用 Taq 酶的 5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接受到荧光信号。 3.3　Ct 值 实时荧光 PCR 检测中每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。以正式出版文本为准2 SN / T 5173—20214 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BHQ1 ：黑洞淬灭基团 BHQ1（Black Hole Quencher1）FAM ：6- 羧基荧光素 FAM（ 6-carboxy-fluorescein） 5 生物安全和 PCR 防污染要求 按照 GB 19489、 《人间传染的病原微生物名录》和《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒） 种或样本运输管理规定》确定的要求，立克次体相关材料的生物安全要求如下： ——立克次体危害程度分类为第二类； ——立克次体相关的病原培养和动物感染实验操作应在生物安全Ⅲ级（BSL3 或 ABSL3）实验室 内进行； ——立克次体相关的未经培养的感染性材料的操作应在生物安全Ⅱ级（BSL2 或 ABSL2）实验室 内进行； ——立克次体相关的灭活材料及无感染性材料的操作可在生物安全Ⅰ级（BSL1 或 ABSL1）实验 室内进行； ——立克次体感染性材料运输包装分类为 A 类，UN 编号为 UN 2814 ；—— PCR 防污染措施按照 WS/T 230 确定的规定执行。 6 检测对象 国境口岸发现的可疑病例或媒介蜱。 7 仪器 本方法使用的主要仪器如下：——荧光定量 PCR 仪；——超净工作台；—— II 级生物安全柜；——高压灭菌锅；——低温高速离心机：最大离心力 20 000 g； ——涡旋振荡器；——冰箱：4 ℃、-20 ℃和 -70 ℃ ；——移液器：1 mL、10 mL、20 mL、100 mL、200 mL 和 1 mL。 8 试剂 本方法使用的主要试剂如下：以正式出版文本为准3 SN / T 5174—2021——核酸提取试剂：德国 Qiagen 公司 QNeasy Blood ﹠ Tissue Kit 提取病毒核酸1）； —— PCR 试剂：美国 ThermoFisher 公司 TaqMan Universal Master Mix II1）； ——引物和探针序列见表 1。 表 1 立克次体荧光 PCR 检测反应体系 名称 体积 2×PCR 缓冲液 12.5 µL 上游引物（终浓度） 200 nmol/L 下游引物（终浓度） 200 nmol/L 探针（终浓度） 100 nmol/L 水 补足到 25 µL 上游引物（5’-3’ ） ：TTTATGTCYACTGCTTCTTG 下游引物：TAATAGCCATAGGATGAGAAG探针：FAM-CACCTATATAGACGGTGATAAAGGAATCTTGCGGC -BHQ1 注：等效的引物和探针或其他等效的商品化检测试剂盒也可使用。 9 检验程序 9.1 样本的采集、运输和保存 9.1.1 人血清 无菌采集疑似病例发病 14 天内静脉血 3 mL ～ 5 mL，室温静置 30 min 使其凝固，500 g离心 10 min，收集血清于 2 mL 无菌螺口塑料管中，用耐低温油性记号笔记上编号，低温送到实验室检测。 如 24 h 内不能送到实验室，将血清置于 -70 ℃保存。 9.1.2 蜱 按照 SN/T 1293 要求采集蜱标本，将蜱装至大小适合、带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内，用耐低 温油性记号笔记上编号，低温运输或 -70 ℃以下保存待检。9.2 样本处理 人血清样本不需进行处理，直接可用于核酸提取。单只蜱虫标本用 75% 酒精浸泡 10 min 后，用 无菌蒸馏水反复冲洗 3 次。最后加入 500 mL 生理盐水研磨，研磨液用于提取 DNA。 9.3 核酸提取 核酸提取采用 QNeasy 血液组织核酸提取试剂盒进行或其它等效提取方法，以下给出所提供试剂 盒具体操作步骤案例，实际操作时按说明书进行。 吸取 200 mL 血清样本或蜱研磨液加入加 20 mL 蛋白酶 K ； 加入 200 mL 缓冲液 AL，涡旋震荡充分混匀，56 ℃孵育 10 min ；加入 200 mL 的（96%~100%）酒精，涡旋震荡充分混匀；移取混合液至离心柱上，离心柱放在 2 mL 收集管上。6 000 g离心 1 min，弃收集液。 离心柱放至新的 2 mL 收集管上，加 500 mL 缓冲液 AW1， 6 000 g离心 1 min，弃收集管 / 液； 1） 　由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品 具有相同的效果，则可使用这些等效产品。以正式出版文本为准4 SN / T 5173—2021离心柱放至新的 2 mL 收集管上，加 500 mL 缓冲液 AW2，20 000 g离心 1 min，弃收集管/ 液； 将离心柱放在一个新的 1.5 或 2 mL 收集管上，吸 200 mL 缓冲液 AE 在吸附膜上，室温 1 min， 6 000 g离心 1 min ； 收集滤出液，即为核酸 DNA 溶液，做好标记，-70 ℃储存待用。 9.4 配制反应体系 荧光定量 PCR 采用 TaqMan Universal Master Mix II 试剂盒进行或其它等效 Taqman 荧光 PCR 方法， 以下给出所提供试剂盒具体操作步骤案例，实际操作时按说明书进行。 9.5 荧光 PCR 扩增反应 上述分装好的 PCR 管中加入 5 µL 模板 DNA，每个反应体系均设立阴性对照和阳性对照，阳性对 照模板为用立克次体扩增片段构建的阳性质粒 DNA，阴性对照为不含立克次体核酸的标本或无菌水。 将上述 PCR 管放入荧光定量 PCR 仪上进行扩增反应。以 ABI 7500 型荧光定量 PCR 仪为例，设定为Reporter Dye ：FAM，Quencher Dye ：NONE，Passive Reference ：ROX。不同实验室可根据所使用的试剂和仪器参考上述反应条件做适当调整。见表 2。 表 2 立克次体荧光 PCR 检测反应程序 步骤 反应温度 反应时间 循环数 变性 95 ℃ 8 min 1 扩增及荧光收集95 ℃ 5 s 45 60 ℃ 30 s 9.6 结果分析 9.6.1 阈值确定 以荧光 PCR 反应的前 3 ～ 15 个循环的荧光信号作为荧光本底