以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5173 —2021 中华人民共和国海关总署 发 布ICS 11. 020 CCS C 62 2021 -06-18发布 2022 -01-01 实施国境口岸蜱传腹地病毒 实时荧光 RT-PCR 检测方法 Real-time RT-PCR method for detecting Heartland Virus in ticks at frontier ports 以正式出版文本为准以正式出版文本为准I SN/T 5173—2021前 言 本文件按照 GB/T 1.1— 2020《标准化工作导则　第 1 部分标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国合肥海关、中华人民共和国重庆 海关、中华人民共和国扬州海关、中华人民共和国广州海关。 本文件主要起草人：刘丽娟、石泉、骆星丹、王春、张晓龙、王静、慈颖、杨宇、郭天宇、戴俊。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5173—2021国境口岸蜱传腹地病毒 实时荧光 RT-PCR 检测方法 1　范围 本文件规定了国境口岸蜱传腹地病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法，包括样本前处理、检测程序、 方法、结果判定及报告。 本文件适用于检验检疫机构对人及蜱携带腹地病毒的核酸检测。 2　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）租 用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求SN/T 1293 国境口岸蜱类监测规程WS/T 230 临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫生部　卫科教发〔2006〕15 号） 3　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1　腹地病毒 Heartland virus ， HRTV 单股负链节段性 RNA 病毒，属于布尼亚病毒科的白蛉病毒属，有 S、M 和 L 片段。其中，L 片 段编码 RNA 依赖性 RNA 多聚酶，M 片段编码糖蛋白 Gn 和 Gc，S 片段编码核衣壳蛋白和非结构蛋白。腹地病毒主要经蜱传播，经蜱叮咬后，人可出现发热及血小板减少等症状。 3.2　逆转录聚合酶链反应 reverse transcription polymerase chain reaction ；RT-PCR 将 RNA 逆转录（RT）和 cDNA 聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。本标准采用一步法逆转 录聚合酶链式反应（RT-PCR） 。在一步法 RT-PCR 中，首先以 RNA 为模板，利用下游特异性引物， 在依赖 RNA 的 DNA 聚合酶（逆转录酶）作用下转录合成互补 DNA（cDNA） ，该步骤称作“逆转录” ；随后，再以 cDNA 为模板，利用上游和下游特异性引物，在 DNA 聚合酶的作用下进行 PCR 循环扩增；最终使 RNA 分子的某个特定区域（目的片段）被扩增达几百万倍。 3.3　实时荧光 RT-PCR real-time fluorescence RT-PCR 是在常规 RT-PCR 的基础上，加入一条特异性的荧光探针。该探针为一段寡聚核苷酸，两端分 别标记 1 个荧光报告基团和 1 个荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸 收；PCR 扩增时，利用 Taq 酶的 5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号。以正式出版文本为准2 SN/T 5173—20214　缩略语 下列缩略语适用于本文件： —— bp ：碱基对（base pair） ；—— Ct 值：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数（Cycle threshold） ；—— DEPC ：焦碳酸乙二酯（diethyl pyrocarbonate） ；—— FAM ：6- 羧基－荧光素（6-carboxy-fluorescein） 。 5　检测对象 5.1　国境口岸现场采集的蜱虫样本。 5.2　疑似被蜱虫叮咬且不能排除腹地病毒感染的人员。 6　生物安全和 PCR 防污染要求 按照 GB 19489 和 《人间感染的病原微生物名录》 的要求，腹地病毒相关材料的生物安全要求如下： ——腹地病毒危害程度分类为第三类；——未经培养的腹地病毒感染性材料的操作应该在生物安全二级（BSL-2）实验室内进行；——腹地病毒相关的灭活材料和无感染性材料操作可在生物安全一级（BSL-1）实验室内进行；——腹地病毒感染性材料运输和包装分为 B 类，UN 编号为 UN 3373。PCR 防污染措施按照 WS/T 230 确定的规定执行。 7　主要仪器 主要仪器设备如下：——荧光定量 PCR 仪；——二级生物安全柜；——高压灭菌器；—— -70 ℃超低温冰箱；——台式离心机；——漩涡振荡器。 8　主要试剂 主要试剂如下：—— DEPC 水；—— RNA 提取试剂盒：QIAamp Viral RNA kit，详见试剂盒说明书，内含 AVL、AW1、AW2 和 AVE 等 1）； ——一步法荧光 RT-PCR 试剂盒：Ag-Path-IDTM one step RT-PCR kit1）； ——引物和探针：序列见表 1。 1） 　由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产 品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。以正式出版文本为准3 SN/T 5173—2021表 1　引物和探针序列 引物 / 探针名称 序列（5’-3’ ） 扩增片段 F GTGAGAGCAAATACAATGA 扩增片段为 113 bp R AGGAGATAGCTTATGAGG Probe FAM- TCACATCATTCCTCCAGTTCTCACC -BHQ1 　　注： 探针的 5’端标记的是 FAM 荧光报告基团，3’端标记的是 BHQ1 荧光淬灭基团。其他等效荧光标记物和 淬灭基团或等效的引物和探针或其他等效的商品化检测试剂盒也可使用。 9　检验程序 9.1　样本采集 9.1.1　蜱虫样本的采集 按照 SN/T 1293 执行。 9.1.2　人血清样本的采集 无菌采集疑似病例发病 3 d 内静脉血 5 mL，室温静置 30 min 使其凝固，1 500 r/min ～3 000 r/min 离心 10 min，收集血清于 2 mL 无菌螺口塑料管中，用耐低温油性记号笔登记编号，低温送到实验室 检测。如 24 h 内不能送到实验室，应将血清置于 -70 ℃冰箱保存。 9.2　实验室检验9.2.1　样本处理9.2.1.1　蜱虫标本 在无菌操作台上，将蜱取出放在无菌的平皿内，用 75% 酒精浸泡 20 min，用无菌滤纸吸干蜱体 表酒精，再用生理盐水漂洗 3 次，用无菌滤纸吸干蜱体表水分后，倒入研磨器中，加入 1 mL PBS 或 生理盐水吹洗，弃去液体后加入 1 mL PBS 或生理盐水，反复研磨至组织碎片基本消失，随后将研磨液吸入到 1.5 mL 离心管，预冷 4 ℃的离心机 20 000 r/min 离心 10 min，取上清液即可进行病毒核酸提取。 9.2.1.2　血清标本 血清样本直接进行分子生物学核酸的提取，如 24 h 不能及时检测应存放在 -70 ℃冰箱。 9.2.2　病毒核酸提取 参照商品化 RNA 核酸提取试剂盒说明书进行。 9.2.3　实时荧光 RT-PCR 检测9.2.3.1　引物和探针 引物和探针应用液浓度配制成 10 μmol/L。 9.2.3.2　阳性对照和空白对照设置 检测过程中分别设阳性对照和空白对照。阳性对照为克隆腹地病毒的部分核苷酸序列（必须包含以正式出版文本为准4 SN/T 5173—2021扩增区域在内）在体外转录合成的 cDNA ；空白对照用无菌水。 9.2.3.3　反应体系组成 反应体系组成见表 2 ： 表 2　腹地病毒实时荧光 RT-PCR 反应体系 成分 体积 DEPC 水 7 mL 2×RT-PCR Buffer 12.5 mL 10 mmol/L Primer F 1 mL 10 mmol/L Primer R 1 mL 10 mmol/L probe 0.5 mL Enzyme Mix 1 mL 模板 RNA/ 阴性对照 / 阳性对照 2 mL 　　注：腹地病毒实时荧光 RT-PCR 的反应总体系为 25 μL。 9.2.3.4　反应条件 一步法实时荧光 RT-PCR 反应条件：扩增条件为 45 ℃ 10 min 1 次；95 ℃ 10 min 1 次；95 ℃ 15 s， 60 ℃ 45 s，共 40 个循环。 每个循环结束时采集荧光信号。 选择 FAM 通道于 60 ℃退火时收集荧光信号； 设置 ROX 通道为参比通道。不同实验室可根据所使用的试剂和仪器参考上述反应条件作适当调整。 9.2.4　检验结果判断及报告9.2.4.1　阈值确定 阈值确定的方法对所有的样本都是统一的，一般是以实时荧光 PCR 反应的前 3 个 ～15 个循环的 荧光信号作为荧光本底信号，以本底信号标准差的 10 倍作为荧光阈值，以样本扩增产生的荧光信号 达到荧光阈值时所对应的循环数为循环阈值（Ct 值） 。 9.2.4.2 质量控制 反应结果应同时符合以下 2 个条件： ——阴性对照物扩增曲线