中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5169—2019 出口动物源食品中美替诺龙的测定 液相色谱 - 质谱 / 质谱法 Determination of methenolone in animal-origin foodstuffs for export — LC-MS / MS method 2019-10-25 发布 2020-05-01 实施 中华人民共和国海关总署 发 布ICS 67.050 C 53 I SN / T 5169—2019前 言 本标准按照 GB / T 1.1— 2009 给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国武汉海关。本标准主要起草人：叶诚、罗静、王晗、王鹏、陈孝宇、赵晓亚、尚吟竹、王振华、戴琳。1 SN / T 5169—2019出口动物源食品中美替诺龙的测定 液相色谱 - 质谱 / 质谱法 1 范围 本标准规定了出口动物源食品中美替诺龙残留量的液相色谱 - 质谱 / 质谱的测定方法。 本标准适用于猪肉、牛肉、羊肉、鸡蛋和牛奶中美替诺龙残留量的测定，其他食品也可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB / T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 方法提要 试样经均质处理和酶解后，采用甲酸 - 乙腈提取，固相萃取或分散固相萃取方法净化，液相 色谱 - 质谱 / 质谱仪测定，内标法定量。 4 试剂和材料 除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为 GB / T 6682 规定的一级水。 4.1 甲醇（CH3OH，CAS 号：67-56-1） ：色谱纯。 4.2 乙腈（CH3CN，CAS 号：75-05-8） ：色谱纯。 4.3 甲酸（HCOOH，CAS 号：64-18-6） ：色谱纯。 4.4 乙酸（CH3COOH，CAS 号：64-19-7） 。 4.5 无水乙酸钠（CH3COONa，CAS 号：127-09-3） 。 4.6 无水硫酸钠（Na2SO4，CAS 号：7757-82-6） 。 4.7 无水硫酸镁（MgSO4，CAS 号：7487-88-9） 。 4.8 β- 葡萄糖醛酸酶 / 芳基硫酸酯酶溶液： β- 葡萄糖醛酸酶活力 >100 000 units / mL ；芳基硫酸酯酶 活力＜ 20 000 units / mL。 4.9 美替诺龙标准物质（C20H30O2，CAS 号：153-00-4） ：纯度大于等于 99%。 4.10 甲睾酮 -d3标准物质（C20H27D3O2，CAS 号：96425-03-5） ：纯度大于等于 98%。 4.11 1% 甲酸乙腈溶液：量取 1.0 mL 甲酸（4.3） ，用乙腈（4.2）定容至 100 mL，混匀。 4.12 0.1% 甲酸水溶液：量取 1.0 mL 甲酸（4.3） ，用水定容至 1 000 mL，混匀。 4.13 定容液：量取 70 mL 0.1 % 甲酸水溶液（4.12）和 30 mL 乙腈（4.2） ，混匀。 4.14 0.2 mol / L 乙酸钠缓冲液：称取 16.4 g 无水乙酸钠（4.5） ，溶解于 1 000 mL 水中，用适量乙酸 （4.4）调节 pH 至 5.2。 4.15 美替诺龙标准储备液：称取适量美替诺龙标准物质 （4.9） （精确至 0.000 1 g） ，用甲醇（4.1） 溶解，配制成浓度为 1 000 mg / L 的标准储备液，置于 -18 ℃条件下避光保存，有效期 3 个月。2 SN / T 5169—20194.16 甲睾酮 -d3内标储备液：称取适量甲睾酮 -d3标准物质 （4.10，精确至 0.000 1 g） ，用甲醇 （4.1） 溶解，配制成浓度为 100 mg / L 的标准储备液，置于 -18 ℃条件下避光保存，有效期 3 个月。 4.17 美替诺龙标准中间溶液：根据需要准确移取适量美替诺龙标准储备液 （4.15） ，用甲醇（4.1） 稀释，配制成浓度为 100 μg / L 的标准中间溶液，置于 -18 ℃条件下避光保存，有效期 1 个月。 4.18 甲睾酮 -d3内标工作溶液：根据需要准确移取适量甲睾酮 -d3内标储备液 （4.16） ，用甲醇 （4.1） 稀释，配制成浓度为 100 μg / L 的内标工作溶液，置于 -18 ℃条件下避光保存，有效期 1 个月。 4.19 标准工作溶液：准确移取适量美替诺龙标准中间溶液 （4.17） 和甲睾酮 -d3内标工作溶液 （4.18） ， 用初始流动相稀释成浓度分别为 0.5 μg / L、1.0 μg / L、2.0 μg / L、5.0 μg / L、10 μg / L 和 20 μg / L 的 系列标准溶液，并保证各标准溶液中甲睾酮 -d3的内标浓度为 5 μg / L。 4.20 PRiME HLB 固相萃取柱：6 mL（200 mg）或性能相当者。 4.21 乙二胺 - N- 丙基硅烷化硅胶（PSA） ：40 μm~60 μm。 4.22 十八烷基硅烷键合硅胶（C18） ：40 μm~60 μm。 4.23 微孔滤膜：通用型，0.22 μm。 5 仪器与设备 5.1 液相色谱 - 质谱 / 质谱仪：配电喷雾离子源（ESI） 。 5.2 组织捣碎机。 5.3 振荡器。 5.4 涡旋混合器。 5.5 电子分析天平：感量为 0.000 1 g 和 0.01 g。 5.6 高速冷冻离心机：转速不低于 8 000 r / min。 5.7 氮气吹干仪。 5.8 pH 计。 5.9 水浴锅。 6 试样制备与保存 6.1 试样制备 6.1.1 猪肉、牛肉、羊肉 猪肉 、牛肉、羊肉各约 500 g，放入组织捣碎机均质，充分混匀，均分成 2 份，分别装入清洁容 器内，并标明标记。 6.1.2 鸡蛋 取 16 枚新鲜鸡蛋（约 1 kg） ，洗净、去壳后充分混匀，均分成 2 份，分别装入清洁容器内，并标 明标记。6.1.3 牛奶 将牛奶从冰箱中取出，放置至室温、摇匀，备用。 制样操作过程中，应防止样品受到污染或者发生残留物含量的变化。3 SN / T 5169—20196.2 试样保存 猪肉、牛肉、羊肉、鸡蛋试样于 -20 ℃以下条件下保存；牛奶试样置于 0 ℃~4 ℃条件下保存。 7 测定步骤 7.1 酶解 称取 2 g 试样（精确至 0.01g）置于 50 mL 具塞离心管中，准确加入 100 μL 甲睾酮 -d3内标工作 溶液（4.18）和 5 mL 0.2 m ol / L 乙酸钠缓冲液（4.14） ，充分混匀，再加 50 μLβ- 葡萄糖醛酸酶 / 芳基 硫酸酯酶溶液（4.8） ，涡旋混匀后，37 ℃±1 ℃水浴酶解 12 h。 7.2 提取 7.2.1 猪肉、牛肉、羊肉 取出离心管冷却至室温，加入 15 mL 1% 甲酸乙腈溶液（4.11） ，涡旋混匀 1 min，置于振荡器振荡 30 min，以 8 000 r / min 转速离心 10 min （温度低于 5 ℃） ，收集上清液，置于另一 50 mL 离心管内，待净化。 7.2.2 鸡蛋、牛奶 取出离心管冷却至室温 ，加入 20 mL 1% 甲酸乙腈溶液（4.11） ，加入 5 g 无水硫酸钠（4.6） ，涡 旋混匀 1 min，置于振荡器振荡 30 min，以 8 000 r / min 转速离心 10 min（温度低于 5 ℃） ，收集上层 有机相，置于另一 50 mL 离心管内，待净化。 7.3 净化 7.3.1 猪肉、牛肉、羊肉 精确 移取 7.2.1 中的待净化上清液 10 mL 至 PRiME HLB 固相萃取柱（4.20）中，保持 1 滴 / s~ 2 滴 / s 的流速，收集全部流出液于玻璃试管中，在 45 ℃下用氮气吹干。残留物用 1.0 mL 定容液（4.13） 溶解，涡旋混匀，过 0.22 μm 微孔滤膜（4.23） ，供液相色谱 - 质谱 / 质谱仪测定。 7.3.2 鸡蛋、牛奶 精确移取 7.2.2 中的待净化液 10 mL 于 50 mL 离心管中，加入 100 mg PSA （4.21） 、40 mg C18（4.22） 和 600 mg 无水硫酸镁（4.7） ，盖上离心管盖，涡旋混合 30 s，以 8 000 r / min 的转速离心 10 min，取 全部上清液于玻璃试管中，在 45 ℃下用氮气吹干，残留物用 1.0 mL 定容液（4.13） 溶解，涡旋混匀， 过 0.22 μm 微孔滤膜（4.23） ，供液相色谱 - 质谱 / 质谱仪测定。 7.4 测定 7.4.1 液相色谱条件 7.4.1.1 色谱柱：C18色谱柱，50 mm×2.1 mm（内径） ，粒径 3.5 μm 或性能相当者。 7.4.1.2 柱温：40 ℃。 7.4.1.3 流动相：A 为 0.1 % 甲酸水溶液 （4.12） ，B 为乙腈 （4.2） ，梯度洗脱，梯度洗脱程序见表 1。4 SN / T 5169—2019表 1 液相色谱的梯度洗脱程序 时间 / min 流动相 A / % 流动相 B / % 0 90 10 1 50 50 8 10 90 10 90 10 7.4.1.4 流速：0.3 mL / min。 7.4.1.5 进样量：10 μL。 7.4.2 质谱条件 7.4.2.1 离子源：电喷