中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5168—2019 出口动物源食品中羟甲烯龙的测定 液相色谱 - 质谱 / 质谱法 Determination of oxymetholone in animal-origin foodstuffs for export — LC-MS / MS method 2019-10-25 发布 2020-05-01 实施 中华人民共和国海关总署 发 布ICS 67.050 C 53 I SN / T 5168—2019前 言 本标准按照 GB / T 1.1— 2009 给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国武汉海关、武汉食品化妆品检验所、中华人民共和国南京 海关。 本标准主要起草人：王鹏、杨永、赵晓亚、王晗、丁涛、王振华、叶诚、罗静。1 SN / T 5168—2019出口动物源食品中羟甲烯龙的测定 液相色谱 - 质谱 / 质谱法 1 范围 本标准规定了出口动物源食品中羟甲烯龙残留量的液相色谱 - 质谱 / 质谱的测定方法。 本标准适用于猪肉、牛肉、羊肉、牛奶和鸡蛋中羟甲烯龙残留量的测定，其他食品也可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB / T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 方法提要 试样经均质酶解、乙醚提取、液相色谱 - 质谱 / 质谱仪测定，外标法定量。 4 试剂和材料 除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为 GB / T 6682 规定的一级水。 4.1 甲酸（HCOOH，CAS 号：64-18-6） 。 4.2 甲醇（CH3OH，CAS 号：67-56-1） ：色谱纯。 4.3 乙醚（C2H5OH5C2，CAS 号：60-29-7） 。 4.4 乙酸（CH3COOH，CAS 号：64-19-7） 。 4.5 三水合乙酸钠（CH3COONa ·3H2O，CAS 号：6131-90-4） 。 4.6 碳酸钠（Na2CO3，CAS 号：497-19-8） 。 4.7 氯化钠（NaCl，CAS 号：7647-14-5） 。 4.8 无水硫酸镁（MgSO4，CAS 号：7487-88-9） 。 4.9 β- 葡萄糖醛酸酶 / 芳基硫酸酯酶溶液（ β-Glucuronidase / aryl sulfatase） ： β- 葡萄糖醛酸酶活力 > 100 000 units / mL，芳基硫酸酯酶活力＜ 20 000 units / mL。 4.10 羟甲烯龙标准物质（oxymetholone， C21H32O3，CAS 号：434-07-1） ：纯度大于等于 98%。 4.11 0.2 mol / L 乙酸钠溶液：称取 13.6 g 三水合乙酸钠 （4.5） ，溶解于 500 mL 水中，用适量乙酸 （4.4） 调节 pH 至 5.2。4.12 饱和碳酸钠溶液：称取约 40 g 碳酸钠（4.6） ，溶解于 100 mL 水中，得到饱和碳酸钠溶液。 4.13 0.1% 甲酸甲醇溶液：移取 1.0 mL 甲酸（4.1） ，用甲醇（4.2）定容至 1 000 mL，混匀。 4.14 0.1% 甲酸水溶液：移取 1.0 mL 甲酸（4.1） ，用水定容至 1 000 mL，混匀。 4.15 0.1% 甲酸甲醇 -0.1% 甲酸水溶液（30 : 70， v / v） ：量取 30 mL 0.1% 甲酸甲醇溶液（4.13）和 70 mL 0.1% 甲酸水溶液（4.14） ，混匀。4.16 羟甲烯龙标准储备液：称取羟甲烯龙标准物质（精确至 0.000 1 g） （4.10） ，用甲醇（4.2） 溶解，2 SN / T 5168—2019配制成浓度为 1.0 mg / mL 的标准储备液，-18 ℃以下避光保存，有效期 3 个月。 4.17 羟甲烯龙标准中间液：准确移取 1.0 mL 羟甲烯龙标准储备液（4.16）于 100 mL 容量瓶中，用 甲醇（4.2）定容至刻度，配制成浓度为 10 µg / mL 的标准中间溶液，于 -18 ℃冰箱内储存。 4.18 基质标准工作液：在对应基质空白样品中添加羟甲烯龙标准中间液（4 .17）25 µL、50 µL、100 µL、 250 µL、500 µL，按照本标准进行前处理，得到基质标准工作液供液相色谱 - 质谱 / 质谱仪测定。 4.19 微孔滤膜：有机系，0.22 µm。 5 仪器和设备 5.1 液相色谱 - 质谱 / 质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI） 。 5.2 组织捣碎机。 5.3 振荡器。 5.4 涡旋混合器。 5.5 分析天平：精确至 0.000 1 g 和 0.01 g。 5.6 离心机：转速不低于 4 000 r / min。 5.7 氮气吹干仪。 6 试样制备与保存 6.1 试样制备 6.1.1 猪肉、牛肉、羊肉 猪肉 、牛肉、羊肉，各约 500 g 放入组织捣碎机均质，充分混匀，均分成 2 份，分别装入清洁容 器内，并标明标记。 6.1.2 鸡蛋 取 1 6 枚新鲜鸡蛋（约 1 kg） ，洗净、去壳后充分混匀，均分成 2 份，分别装入清洁容器内，并 标明标记。6.1.3 牛奶 将牛奶从冰箱中取出，放置至室温，摇匀，备用。 制样操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。 6.2 试样保存 猪肉、牛肉、羊肉、鸡蛋试样于 -20 ℃以下 保存，牛奶试样置于 0 ℃~4 ℃条件下保存。 7 测定步骤 7.1 提取 称取 约 5g 试样（精确至 0.01g）置于 50 mL 离心管中，准确加入 10mL 乙酸钠溶液（4.11） ，加 入 25 µLβ- 葡萄糖醛酸酶 / 芳基硫酸酯酶溶液 （4.9） ，涡旋混匀，37 ℃水浴 2 h。 向离心管中加入约 1.5 mL 饱和碳酸钠溶液（4.12）使混合溶液 pH 为 10，加入 20 mL 乙醚（4.3） 、5 g 氯化钠（4.7）和 2 g 无水硫酸镁（4.8） ，剧烈摇晃后涡旋混匀 1 min，振荡提取 30 min，以 4 000 r / min 的转速离心 5 min，3 SN / T 5168—2019冷冻至水相结冰，取上层乙醚于 50 mL 离心管中，用氮气吹至近干，准确加入 1.0 mL 0.1% 甲酸甲 醇 -0.1% 甲酸水溶液（30 : 70， v / v） （4.15）溶解残渣，过 0.22 µm 微孔滤膜（4.19） ，供液相色谱 - 质 谱 / 质谱仪测定。 注：由于在提取过程中使用的乙醚为极易挥发并具有麻醉作用的有机溶剂，溶剂提取过程宜在通风橱内完成。 7.2 测定 7.2.1 液相色谱条件 7.2.1.1 色谱柱：C18色谱柱，100 mm×3.0 mm（内径） ，粒径 3.5 µm 或性能相当者。 7.2.1.2 柱温：30 ℃。 7.2.1.3 流动相：A 为 0.1% 甲酸水溶液，B 为 0.1% 甲酸甲醇溶液，梯度洗脱，洗脱程序见表 1。 表 1 液相色谱的梯度洗脱程序 时间 / min 流动相 A / % 流动相 B / % 0.00 70 30 1.00 70 30 2.00 30 70 3.00 30 70 4.00 5 95 8.00 5 95 8.10 70 30 10.00 70 30 7.2.1.4 流速：0.4 mL / min ； 7.2.1.5 进样量：5 µL。 7.2.2 质谱条件 7.2.2.1 离子源：电喷雾离子源（ESI） 。 7.2.2.2 扫描方式：正离子扫描。 7.2.2.3 检测方式：多反应监测模式（MRM） 。 7.2.2.4 监测离子对、定量离子对见表 2。 表 2 羟甲烯龙的监测离子对、定量离子对 被测物 监测离子对（m / z） 定量离子对（m / z） 羟甲烯龙333.0 / 99.0 333.0 / 159.2333.0 / 99.0 7.2.2.5 雾化气、气帘气 、辅助气、碰撞气均为高纯氮气及其他适合气体，使用前应调节各气体流 量以使质谱灵敏度达到检测要求，喷雾电压、去簇电压、碰撞气能量等参数值应优化至最佳灵敏度，其他参考质谱参数参见附录 A。4 SN / T 5168—20197.2.3 液相色谱 - 质谱 / 质谱测定 7.2.3.1 定性测定 按照液相色谱 - 质谱 / 质谱条件测定试样和基质标准工作液，试样中目标化合物的保留时间与基 质标准工作液中对应化合物的保留时间偏差在 ±2.5% 之内；定性离子对的相对丰度与浓度相当的基 质标准工作液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表 3 的规定，且每个离子的信噪比均≥ 3，则可 判断试样中存在相应的被测物。 表 3 定性离子对相对丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 / % >50 20~50（含） 10 ~20（含） ≤ 10 允许的相对偏差 / % ±20 ±25 ±30 ±50 7.2.3.2 定量测定 将基质标准工作液和试样溶液依次注入液相色谱 - 质谱 / 质谱仪中，测得定量离子峰面积。基质 标准工作液和待测样液中，羟甲烯龙的响应值均应在仪器检测的定量线性范围内。 在上述仪器条件下，羟甲烯龙的提取离子色谱图参见附录 B。 7.3 空白试验 除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行。 8 结果计算和表述 采用基质匹配标准工作曲线定量，试样中羟甲烯龙的含量由液相色