中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/ T 5167—2019 出口动物源食品中氢氯噻嗪等 10 种 利尿剂残留量的测定 液相色谱 - 质谱 / 质谱法 Determination of 10 diuretic residues including hydrochlorothiazide et al in animal-origin foodstuffs for export —LC-MS / MS method 2019-10-25 发布 2020-05-01 实施 中华人民共和国海关总署 发 布ICS 67.050 C 53 I SN / T 5167—2019前 言 本标准按照 GB / T 1.1— 2009 给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国武汉海关、湖北省食品质量安全监督检验研究院。本标准主要起草人：赵晓亚、范志勇、叶诚、王鹏、尚吟竹、王晗、罗静、王振华、付晓芳、 李晶。1 SN / T 5167—2019出口动物源食品中氢氯噻嗪等 10 种利尿剂残留量的测定 液相色谱 - 质谱 / 质谱法 1 范围 本标 准规定了出口动物源食品中氢氯噻嗪、氯噻嗪、氨苯喋啶、丙磺舒、氯噻酮、乙酰唑胺、 呋塞米、精磺胺、螺内酯、坎利酮残留量的液相色谱 - 质谱 / 质谱的测定方法。 本标准适用于猪肉、牛肉、羊肉、牛奶和鸡蛋中氢氯噻嗪、氯噻嗪、氨苯喋啶、丙磺舒、氯噻 酮、乙酰唑胺、呋塞米、精磺胺、螺内酯、坎利酮残留量的测定，其他食品也可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB / T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 方法提要 试样经均质处理后，称取适量加入磷酸二氢钾 ，用乙腈提取，经分散固相萃取方法净化，液 相色谱 - 质谱 / 质谱仪测定，外标法定量。4 试剂和材料 除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为 GB / T 6682 规定的一级水。 4.1　甲酸（HCOOH，CAS 号：64-18-6） 。 4.2　甲醇（CH3OH，CAS 号：67-56-1） ：色谱纯。 4.3　乙腈（CH3CN，CAS 号：75-05-8） ：色谱纯。 4.4　磷酸二氢钾（KH2PO4，CAS 号：7778-77-0） 。 4.5　无水硫酸镁（MgSO4，CAS 号：7487-88-9） 。 4.6　0.1% 甲酸甲醇溶液：准确移取 1.0 mL 甲酸（4.1） ，用甲醇（4.2）定容至 1 000 mL。4.7　水 -0.1% 甲酸甲醇溶液（70 ： 30， v / v） ：移取 30 mL 0.1% 甲酸甲醇溶液（4.6）和 70 mL 水，混匀。 4.8　标准物质：坎利酮、螺内酯、氢氯噻嗪、氯噻嗪、乙酰唑胺、呋塞米、精磺胺、丙磺舒、氨苯喋啶和氯噻酮标准物质的纯度均≥ 98%，标准物质的化合物信息参见附录 A。4.9　标准储备液：称取适量标准物质（4.8） （精确至 0.000 01 g） ，分别用甲醇（4.2）溶解，配制成浓度为 0.5 mg / mL 标准储备液，于 -18 ℃以下保存，有效期 3 个月。 4.10 　混合标准中间液：用甲醇（4.2）将各标准储备液混合，稀释成氢氯噻嗪、氯噻嗪、氨苯喋啶、 丙磺舒、氯噻酮的 1.0 μg / mL 混合标准中间液和乙酰唑胺、呋塞米、精磺胺、螺内酯、坎利酮的 1.0 μg / mL 的混合标准中间液，于 0 ℃~4 ℃保存，有效期 1 个月。 4.11 　基质混合标准工作液：准确吸取一定量的混合标准中间液（4.10） ，用空白基质溶液逐级稀释 成氢氯噻嗪、氯噻嗪、氨苯喋啶、丙磺舒、氯噻酮浓度为 5.0 μg / L、10.0 μg / L、20.0 μg / L、50.0 μg / L、2 SN / T 5167—2019100.0 μg / L 和乙酰唑胺、呋塞米、精磺胺、螺内酯、坎利酮浓度为 10.0 μg / L、20.0 μg / L、50.0 μg / L、 100.0 μg / L、200.0 μg / L 的基质混合标准工作液，现用现配。 4.12 　乙二胺 -N- 丙基硅烷化硅胶（PSA） ：40 μm~60 μm。 4.13 　十八烷基硅烷键合硅胶（C18） ：40 μm~60 μm。 4.14 　石墨化碳黑（GCB） ：40 μm~120 μm。 4.15 　微孔滤膜：有机系，0.22 μm。 5　仪器与设备 5.1　液相色谱 - 质谱 / 质谱仪：配电喷雾离子源（ESI） 。 5.2　组织捣碎机。5.3　振荡器。5.4　涡旋混合器。5.5　分析天平：感量为 0.000 01 g 和 0.01 g。5.6　冷冻离心机：10 000 r / min。5.7　氮气吹干仪。 6　试样制备与保存 6.1　试样制备6.1.1　猪肉、牛肉、羊肉 猪肉、牛肉、羊肉各约 500 g，放入组织捣碎机均质，充分混匀，均分成 2 份，分别装入清洁容 器内，并标明标记。6.1.2　鸡蛋 取 16 枚新鲜鸡蛋（约 1 kg） ，洗净、去壳后充分混匀，均分成 2 份，分别装入清洁容器内，并标 明标记。6.1.3　牛奶 将牛奶从冰箱中取出，放置至室温、摇匀，备用。 制样操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。 6.2　试样保存 猪肉、牛肉、羊肉、鸡蛋试样于 -20 ℃以下条件下保存；牛奶试样置于 0 ℃~4 ℃条件下保存。 7　测定步骤 7.1　提取 称取约 2 g 试样（精确至 0.01 g）置于 50 mL 离心管中，加入 10 mL 乙腈（4.3）和 2 g 磷酸二氢 钾（4.4） ，振荡提取 30 min 后，于 0 ℃以 9 000 r / min 的转速离心 5 min，取出上清液，再加入 10 mL 乙腈（4.3）重复提取 1 次，离心后合并上清液于 50 mL 离心管中，待净化。3 SN / T 5167—20197.2　净化 在 7.1 中的待净化上清液中加入 150 mg 无水硫酸镁（4.5） 、50 mg PSA（4.12） 、50 mg C18（4.13） 、 7.5 mg GCB（4.14） ，涡旋混合 30 s 后，于 0 ℃以 9 000 r / min 离心 5 min，取全部上清液，于 45 ℃ 下用氮气吹至近干，准确加入 2.0 mL 水 -0.1% 甲酸甲醇溶液（4.7）溶解残渣，过 0.22 μm 微孔滤膜 （4.15） ，供液相色谱 - 质谱 / 质谱仪测定。 7.3　空白基质提取液 取经测定不含被测组分的试样按 7.1 和 7.2 操作，获得空白基质提取液。 7.4　测定 7.4.1　液相色谱条件7.4.1.1 色谱柱：C18色谱柱，150 mm×2.1 mm（内径） ，粒径 3.5 μm 或性能相当者。 7.4.1.2 柱温：30 ℃。 7.4.1.3 流动相：A 为水，B 为 0.1% 甲酸甲醇溶液（4.6） ，梯度洗脱，洗脱程序见表 1。 表 1 液相色谱的梯度洗脱程序 时间 / min 流动相 A / % 流动相 B / % 0.00 90 10 1.00 90 10 3.5 35 65 11 3 97 11.5 90 10 15 90 10 7.4.1.4 流速：0.3 mL / min。 7.4.1.5 进样量：5 μL。 7.4.2　正离子扫描模式质谱条件7.4.2.1 离子源：电喷雾离子源（ESI） 。 7.4.2.2 扫描方式：正离子扫描。 7.4.2.3 检测方式：多反应监测（MRM） 。 7.4.2.4 雾化气、气帘气 、辅助气、碰撞气均为高纯氮气及其他适合气体，使用前应调节各气体流 量以使质谱灵敏度达到检测要求，喷雾电压、去簇电压、碰撞气能量等参数值应优化至最佳灵敏度， 参考质谱参数参见附录 B。 7.4.3　负离子扫描模式质谱条件7.4.3.1 离子源：电喷雾离子源（ESI） 。 7.4.3.2 扫描方式：负离子扫描。4 SN / T 5167—20197.4.3.3 检测方式：多反应监测（MRM） 。 7.4.3.4 雾化气、气帘气 、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他适合气体，使用前应调节各气 体流量以使质谱灵敏度达到检测要求，喷雾电压、去簇电压、碰撞气能量等参数值应优化至最佳灵敏 度，其他参考质谱参数参见附录 B。 7.4.4　液相色谱 - 质谱 / 质谱测定7.4.4.1 定性测定 按照液相色谱 - 质谱 / 质谱条件测定试样和基质混合标准工作液，试样中目标化合物的保留时间 与基质混合标准工作液中对应化合物的保留时间偏差在 ±2.5% 之内；定性离子对的相对丰度与浓度 相当的基质混合标准工作液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表 2 的规定，且每个离子的信噪比 均≥ 3，则可判断试样中存在相应的被测物。 表 2 定性离子对相对丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 / % >50 20~50（含） 10~20（含） ≤ 10 允许的相对偏差 / % ±20 ±25 ±30 ±50 7.4.4.2 定量测定 将基质混合标准工作液和试样溶液依次注入液相色谱 - 质谱 / 质谱仪中，测得定量离子峰面积。 待测样液中利尿剂的响应值均应在仪器检测的定量线性响应范围内。在上述仪器条件下，10 种利尿剂的提取离子色谱图参见附录 C。 7.5　空白试验 除不加试样外，均按上述测定