书书书犐 犆 犛６ ７．０ ５ ０犆５ ３ 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜５ １ ４ ５．１—２ ０ １ ９ 出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法 　第１部分：猫成分检测犘 犆 犚 试纸条法 犚 犪狆犻 犱犐 犱 犲 狀 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犪 狀 犻 犿 犪 犾 犻 狀 犵狉 犲 犱 犻 犲 狀 狋 犻 狀犲 狓 狆狅 狉 狋 犳 狅 狅 犱犪 狀 犱犳 犲 犲 犱犘 犪 狉 狋１：犇 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀狅 犳犉 犲 犾 犻 狀 犪 犲犐 狀 犵狉 犲 犱 犻 犲 狀 狋犘 犆 犚  犔 犪 狋 犲 狉 犪 犾 犳 犾 狅 狑犱 犻 狆狊 狋 犻 犮 犽犿 犲 狋 犺 狅 犱 ２ ０ １ ９１ ０２ ５发布 ２ ０ ２ ００ ５０ １实施 中华人民共和国海关总署 发 布书书书前　　言 　　Ｓ Ｎ／Ｔ５ １ ４ ５《出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法 》分为以下 １ ３个部分： — — —第１部分：猫成分检测 　Ｐ Ｃ Ｒ 试纸条法 ； — — —第２部分：貂成分检测 　Ｐ Ｃ Ｒ 试纸条法 ； — — —第３部分：鹿成分检测 　Ｐ Ｃ Ｒ 试纸条法 ； — — —第４部分：骆驼成分检测 　Ｐ Ｃ Ｒ 试纸条法 ； — — —第５部分：狗成分检测 　Ｐ Ｃ Ｒ 试纸条法 ； — — —第６部分：牛成分检测 　Ｐ Ｃ Ｒ 试纸条法 ； — — —第７部分：绵羊成分检测 　Ｐ Ｃ Ｒ 试纸条法 ； — — —第８部分：驴成分检测 　Ｐ Ｃ Ｒ 试纸条法 ； — — —第９部分：狐狸成分检测 　Ｐ Ｃ Ｒ 试纸条法 ； — — —第１ ０部分：鹅成分检测 　Ｐ Ｃ Ｒ 试纸条法 ； — — —第１ １部分：鸭成分检测 　Ｐ Ｃ Ｒ 试纸条法 ； — — —第１ ２部分：火鸡成分检测 　Ｐ Ｃ Ｒ 试纸条法 ； — — —第１ ３部分：鸽子成分检测 　Ｐ Ｃ Ｒ 试纸条法 ；本部分是 Ｓ Ｎ／Ｔ５ １ ４ ５的第１部分。本部分按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口 。本部分起草单位 ：中华人民共和国天津海关 ，天津师范大学 ，中华人民共和国北京海关 ，北京华大蛋白质研发中心有限公司 。本部分主要起草人 ：郑文杰、张宏伟、马丹、赵良娟、李宗梦、张霞、刘伟、孙金生、尹长城。 Ⅰ犛 犖／犜５ １ ４ ５．１—２ ０ １ ９出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法 　第１部分：猫成分检测犘 犆 犚 试纸条法 １　范围 本部分规定了食品及饲料中猫源性成分检测的 Ｐ Ｃ Ｒ 试纸条方法 。本部分适用于肉 、肉制品及饲料中猫源性成分的定性检测 。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２　分析实验室用水规格和试验方法 Ｇ Ｂ／Ｔ１ ４ ６ ９ ９． １ 　饲料　采样 Ｇ Ｂ／Ｔ２ ７ ４ ０ ３ —２ ０ ０ ８　实验室质量控制规范 　食品分子生物学检测 ３　术语、定义和缩略语 ３．１　术语和定义 下列术语和定义适应于本文件 。 ３．１．１猫　犉 犲 犾 犻 狀 犪 犲属于哺乳纲 ，食肉目，猫科，猫属。本标准中猫成分即指猫特异性 ＤＮＡ片段。 ３．２　缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ＤＮＡ：ｄ ｅ ｏ ｘｙｒ ｉ ｂ ｏ ｎ ｕ ｌ ｅ ｉ ｃａ ｃ ｉ ｄ ，脱氧核糖核酸 。 ｄ ＮＴ Ｐ：ｄ ｅ ｏ ｘｙｒ ｉ ｂ ｏ ｎ ｕ ｌ ｅ ｏ ｓ ｉ ｄ ｅｔ ｒ ｉ ｐｈ ｏ ｓｐｈ ａ ｔ ｅ，脱氧核苷酸三磷酸 。 Ｃ ＴＡ Ｂ：ｃ ｅ ｔｙｌ ｔ ｒ ｉ ｔ ｈｙｌ ａ ｍｍ ｏ ｎ ｉ ｕ ｍｂ ｒ ｏ ｍ ｉ ｄ ｅ ，十六烷基三甲基溴化铵 。 Ｔ ｒ ｉ ｓ：Ｔ ｒ ｉ ｓ（Ｈｙｄ ｒ ｏ ｘｙｍ ｅ ｔ ｈｙｌ）ａ ｍ ｉ ｎ ｏ ｍ ｅ ｔ ｈ ａ ｎ ｅ ，三羟甲基氨基甲烷 。 Ｅ ＤＴＡ：Ｅ ｔ ｈｙｌ ｅ ｎ ｅｄ ｉ ａ ｍ ｉ ｎ ｅ ｔ ｅ ｔ ｒ ａ ａ ｃ ｅ ｔ ｉ ｃａ ｃ ｉ ｄ ，乙二胺四乙酸 。 Ｆ Ｉ Ｔ Ｃ：Ｆ ｌ ｕ ｏ ｒ ｅ ｓ ｃ ｅ ｉ ｎ５  ｉ ｓ ｏ ｔ ｈ ｉ ｏ ｃ ｙａ ｎ ａ ｔ ｅ，异硫氰酸盐 。 ４　方法原理 利用裂解液破碎样本细胞 ，苯酚氯仿法抽提基因组 ＤＮＡ，以提取的 ＤＮＡ为模板，采用上游和下游引物分别经异硫氰酸盐 （Ｆ ｌ ｕ ｏ ｒ ｅ ｓ ｃ ｅ ｉ ｎ５  ｉ ｓ ｏ ｔ ｈ ｉ ｏ ｃ ｙａ ｎ ａ ｔ ｅ，Ｆ Ｉ Ｔ Ｃ）和生物素 （Ｂ ｉ ｏ ｔ ｉ ｎ）标记进行 Ｐ Ｃ Ｒ扩增，获得两端分别带有异硫氰酸盐和生物素分子的 Ｐ Ｃ Ｒ产物。用含有金标记的抗异硫氰酸盐的兔多克隆抗 １犛 犖／犜５ １ ４ ５．１—２ ０ １ ９体和固定有链亲和素的通用核酸检测试纸条对 Ｐ Ｃ Ｒ产物进行筛选检测 ，并对Ｐ Ｃ Ｒ阳性产物进行测序确证。 ５　试剂和材料 除另有规定外 ，试剂为分析纯或生化试剂 ，实验用水符合 Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２的要求。 ５．１　猫源性成分检测用引物 （对）序列及标记物为 ：猫成分扩增引物详见表 １。 表１　试验用引物 物种名称 引物序列 （５ ′→３ ′） ５ ′端标记物 靶基因 猫Ｆ：５ ′—Ｃ ＣＡＴＡＣＡＴ Ｃ ＧＧＧＡＣ ＴＧＡＡＣ  ３ ′ 异硫氰酸盐 （Ｆ Ｉ Ｔ Ｃ） Ｒ：５ ′—ＴＧＡＧＴＧＴＴＡＡＡＡＣ ＴＡＧＴＡＣ ＴＡＧＡＡＧＡ  ３ ′ 生物素（ｂ ｉ ｏ ｔ ｉ ｎ）犆 犢犜犅 ５．２　试剂 ５．２．１　Ｅ ｘＴ ａｑＨ ｏ ｔＳ ｔ ａ ｒ ｔＤＮＡ 聚合酶（Ｔ ａｑ，Ｔ ｅ ｒ ｍ ｕ ｓａ ｕ ａ ｔ ｉ ｃ ｕ ） 。 ５．２．２　ｄ ＮＴ Ｐ ｓ：ｄ ＡＴ Ｐ（ｄ ｅ ｏ ｘｙａ ｄ ｅ ｎ ｏ ｓ ｉ ｎ ｅｔ ｒ ｉ ｐｈ ｏ ｓｐｈ ａ ｔ ｅ，脱氧腺苷三磷酸 ） 、ｄ ＴＴ Ｐ（ｄ ｅ ｏ ｘｙｔ ｈｙｍ ｉ ｄ ｉ ｎ ｅｔ ｒ ｉｐｈ ｏ ｓｐｈ ａ ｔ ｅ，脱氧胸苷三磷酸 ） 、ｄ Ｃ Ｔ Ｐ（ｄ ｅ ｏ ｘｙａ ｄ ｅ ｎ ｏ ｓ ｉ ｎ ｅ ｃ ｙｔ ｉ ｄ ｉ ｎ ｅｔ ｒ ｉ ｐｈ ｏ ｓｐｈ ａ ｔ ｅ，脱氧胞苷三磷酸 ） 、 ｄ ＧＴ Ｐ（ｄ ｅ ｏ ｘｙ ｇｕ ａ ｎ ｎ ｏ ｓ ｉ ｎ ｅｔ ｒ ｉ ｐｈ ｏ ｓｐｈ ａ ｔ ｅ，脱氧鸟苷三磷酸 ） 。 ５．２．３　１ ０× Ｐ Ｃ Ｒ 缓冲液：２ ０ ０ｍｍ ｏ ｌ ／ＬＴ ｒ ｉ ｓ  ＨＣ ｌ （ｐＨ ８． ４） ，２ ０ ０ｍｍ ｏ ｌ ／ＬＫＣ ｌ，２ ０ｍｍ ｏ ｌ ／ＬＭｇＣ ｌ２。 ５．２．４　三氯甲烷 （氯仿） 。 ５．２．５　异丙醇。 ５．２．６　Ｃ ＴＡ Ｂ提取液：２ ０ｇ／ＬＣ ＴＡ Ｂ ，１． ４ｍ ｏ ｌ／ＬＮ ａ Ｃ ｌ，０． １ｍ ｏ ｌ／ＬＴ ｒ ｉ ｓ  ＨＣ ｌ ，０． ０ ２ｍ ｏ ｌ ／ＬＮ ａ ２Ｅ ＤＴＡ，ｐＨ８． ０。 ５．２．７　Ｃ ＴＡ Ｂ沉淀液：５ｇ／ＬＣ ＴＡ Ｂ ，４ ０ｍｍ ｏ ｌ ／ＬＮ ａ Ｃ ｌ，ｐＨ８． ０。 ５．２．８　酚／三氯甲烷 ／异戊醇溶液 ：按照Ｔ ｒ ｉ ｓ饱和酚：三氯甲烷 ：异戊醇溶液体积比为 ２ ５∶２ ４∶１ 进行配制。 ５．２．９　三氯甲烷 ／异戊醇溶液 ：按照三氯甲烷 ：异戊醇溶液体积比为 ２ ４∶１进行配制 。 ５．２．１ ０　７ ０％乙醇（Ｖ／Ｖ） 。 ５．２．１ １　Ｎ ａ Ｃ ｌ溶液（１． ２ｍ ｏ ｌ／Ｌ） 。 ５．２．１ ２　蛋白酶Ｋ（２ ０ｍｇ／ｍＬ） 。 ５．２．１ ３　试纸条：含有金标记的抗异硫氰酸盐的兔多克隆抗体和固定有链亲和素的通用核酸检测试纸条，可通过采购的原料试剂自行组装 （参见附录 Ａ）或采用等效的商品化试纸条 。 ５．２．１ ４　展开液：１ ０ｍｍ ｏ ｌ ／ＬＴ ｒ ｉ ｓ、１％Ｂ Ｓ Ａ 、１％（ｖ／ｖ）Ｔｗ ｅ ｅ ｎ ２ ０ 以及浓度为 ０． ０ ５ｍ ｏ ｌ ／Ｌ的Ｎ ａ ＯＨ；或采用等效的商品化产品 。 ６　仪器设备 ６．１　离心机（离心力≥１ ２０ ０ ０ｇ） ，４℃±１℃ 。 ６．２　微量移液器 （１ ０ ０μＬ～１０ ０ ０μＬ，２ ０μＬ～２ ０ ０μＬ，２μＬ～２ ０μＬ，０． ５μＬ～１ ０μＬ） 。 ６．３　Ｐ Ｃ Ｒ仪。 ２犛 犖／犜５ １ ４ ５．１—２ ０ １ ９６．４　恒温水浴锅 ，６ ５℃±１℃ 。 ６．５　天平：感量０． ０ １ｇ。 ６．６　ｐＨ计。 ６．７　核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 ７　检验步骤 ７．１　样品制备 ７．１．１　食品 将固状待检样品研磨混匀 ，分装三份 ，其中一份为检样 ，另外两份为留存样品 。液状样品直接分装 。 加工食品可能富含盐 、糖、植物色素和发酵产生的有色物质等 ，会影响下游实验操作 ，应通过洗涤方式尽量去除样品中的盐 、糖和色素等杂质 。 ７．１．２　饲料 饲料样品按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１ ４ ６ ９ ９． １ 采样，或若粒度为 ２ ０目称取２ ０ ０ｍｇ，６ ０目称取１ ０ ０ｍｇ，１ ０ ０目称取 １ ０ ０ｍｇ。 ７．２　样品犇 犖 犃提取 称取１ ０ ０ｍｇ样品于２ｍＬ离心管中 ，加入１ｍＬＣ ＴＡ Ｂ 提取液，加入１ ０μＬ ２