SN-T 5130-2019 疣粒稻鉴定方法

书书书犐犆犛６２．０２０．０１犅１６中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜５１３０—２０１９疣粒稻鉴定方法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犗狉狔狕犪犵狉犪狀狌犾犪狋犪犖犲犲狊犲狋犃狉狀．犲狓犎狅狅犽．犳．２０１９０９０３发布２０２００３０１实施中华人民共和国海关总署发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院，中华人民共和国合肥海关，中华人民共和国重庆海关。本标准主要起草人：宋云、徐晗、宗凯、许瑾、孙涛、陈乃中。 Ⅰ犛犖／犜５１３０—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.疣粒稻鉴定方法１　范围本标准规定了疣粒稻种质资源的检验鉴定方法。本标准适用于疣粒稻和其遗传材料的检测鉴定。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ／Ｔ１４０７２　林木种质资源保存原则与方法ＳＮ／Ｔ１１９３　基因检验实验室技术要求３　术语、定义和缩略语３．１　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１．１　小穗　狊狆犻犽犲犾犲狋小穗是一个穗状花序，含１至多数小花，花生于颖状苞片内，成熟后又称谷粒。小花花被退化为鳞片状、刚毛状、鳞被状。小穗再排成穗状、指状、总状或圆锥状花序。３．１．２　稃　犺狌狊犽又称谷壳，麸糠。小穗的一部分，由排列整齐、具有乳头状突起的表皮细胞，又分为：内稃，外稃。３．１．３　叶舌　犾犻犵狌犾犲叶片与叶鞘交界处内侧的膜状突起。禾本科植物水稻等具有叶舌。它可使叶片向外倾斜伸出，有利于接受阳光，同时由于它的生长部位，能防止昆虫、病菌、雨水等进入叶鞘筒内。叶舌是叶鞘的延长，其大小、形状和毛茸的有无，可作分类依据之一。禾本科的叶舌，常见的有撕裂状叶舌、二深裂叶舌、短叶舌、具睫毛叶舌和长叶舌等。３．１．４　磷酸丙糖异构酶　犜狉犻狅狊犲狆犺狅狊狆犺犪狋犲犻狊狅犿犲狉犪狊犲，犜犘犐磷酸丙糖异构酶是糖酵解过程中催化二羟丙酮磷酸与３ 磷酸甘油醛之间可逆反应的一种异构酶，其催化功能高度保守，其基因分子结构在生物的长期进化中未发生大的改变，在水稻中是单拷贝、直系同源基因，可作为生物遗传分化和分子进化研究中的重要指标。３．２　缩略语下列缩略语适用于本文件。１犛犖／犜５１３０—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.ＣＴＡＢ：ｃｅｔｙｌｔｒｉｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ，十六烷基三甲基溴化铵。ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，聚合酶链式反应。ＤＮＡ：ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｌｅｉｃａｃｉｄ，脱氧核糖核酸。ｄＮＴＰ：ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，脱氧核苷酸三磷酸。Ｔａｑ酶：栖热水生菌ＤＮＡ聚合酶。４　疣粒稻基本信息学名：ＯｒｙｚａｇｒａｎｕｌａｔａＮｅｅｓｅｔＡｒｎ．ｅｘＨｏｏｋ．ｆ．分类地位：植物界（Ｐｌａｎｔａｅ），被子植物门（Ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍａｅ），单子叶植物纲（Ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｅａｅ），禾本科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ），稻属（犗狉狔狕犪）。稻属内有２０余种（参见附录Ａ）。５　方法原理疣粒稻可能以植株、谷粒、核酸等形式出入境。对于植株、谷粒样品，可通过显微镜观察疑似物种的植株、小穗、外稃，根据形态特征（见附录Ａ、附录Ｂ）进行初步鉴定；对于核酸等无形态特征的样品，根据疣粒稻的ＴＰＩ基因序列特异位点设计引物开展ＰＣＲ检测，进行准确鉴定。６　仪器设备和试剂６．１　仪器和设备液氮罐、纯水机、电子天平、水浴锅、高压灭菌器、高温干燥箱、离心机、电泳仪、ＰＣＲ仪、电泳槽、显微镜、扫描电镜、凝胶成像系统、高通量研磨机、涡旋震荡器、可调移液器（１０００μＬ，２００μＬ，１００μＬ，２０μＬ，１０μＬ，２．５μＬ）、可调移液器枪头、离心管。６．２　试剂ＰＣＲ反应常用试剂、电泳试剂和核酸分子量标准等，均为分析纯或生化纯（另有规定的除外），水按照ＧＢ／Ｔ６６８２规定的执行。７　鉴定方法７．１　形态鉴定７．１．１　稻属植株形态特征一年生或多年生草本。秆直立，丛生。７．１．１．１　叶叶鞘无毛；叶舌长膜质或具叶耳；叶片线形扁平，宽大。７．１．１．２　花顶生圆锥花序疏松开展，常下垂。２犛犖／犜５１３０—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.７．１．１．３　小穗小穗含一两性小花，其下附有２枚退化外稃，两侧甚压扁；颖退化，仅在小穗柄顶端呈二半月形之痕迹；孕性外秤硬纸质，具小疣点或细毛，有５脉，顶端有长芒或尖头；内稃与外稃同质，有３脉，侧脉接近边缘而为外稃之２边脉所紧握；鳞被２；雄蕊６枚；柱头２，帚刷状，自小穗两侧伸出。７．１．２　疣粒稻形态特征（参见附录犃和附录犅）多年生草本。有时具短根状茎。秆高３０－７０厘米，压扁，具５－９节。７．１．２．１　叶叶鞘无毛，长５－８厘米，短于其节间；叶舌长１－２毫米，无毛，具明显叶耳；叶片线状披针形，长５－２０厘米，宽６－２０毫米，上面沿脉有锯齿状粗糙，下面平滑，干时内卷，顶端尖，基部圆形。７．１．２．２　花圆锥花序简单，直立，长３－１２厘米，分枝２－５枚，上升，疏生小穗，棱粗糙。７．１．２．３　小穗小穗长圆形，长约６毫米，约为宽的３倍，浅绿色或灰色；颖退化仅留痕迹；内、外稃表面具钩状乳突且周围具疣粒。７．２　分子生物学鉴定７．２．１　犇犖犃提取按ＣＴＡＢ法提取ＤＮＡ（详见附录Ｃ）。７．２．２　犘犆犚检测对样品提取的ＤＮＡ进行ＰＣＲ检测（详见附录Ｄ）。防污染措施应符合ＳＮ／Ｔ１１９３的规定。８　结果判定符合７．１．１和７．１．２内与样品物态对应的相关描述可初步判定为疣粒稻；样品经符合附录Ｄ描述的ＰＣＲ检测为阳性，可判定为疣粒稻。９　样品保存与复核９．１　样品保存物种资源的样品保存方法见ＧＢ／Ｔ１４０７２的规定。９．２　结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的名称与编号、来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。检测需有最终的实验数据、电泳结果照片等。原始数据应归档，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁。３犛犖／犜５１３０—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.９．３　复核由中华人民共和国海关总署指定的单位或人员负责。主要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。４犛犖／犜５１３０—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.附　录　犃（资料性附录）稻属主要植物分种检索表１ａ．小穗短于２ｍｍ，茎节具毛短粒野稻犗．狊犮犺犾犲犮犺狋犲狉犻 ……………………………………………………… １ｂ．小穗长长于２ｍｍ，茎节通常无毛２ ……………………………………………………………………… ２ａ．外稃无芒，内、外稃表面具疣粒或钩状乳突３ …………………………………………………………… ２ｂ．外稃具芒或小尖头，无疣粒或钩状乳突４ ………………………………………………………………… ３ａ．内、外稃表面具钩状乳突新喀里多野稻犗．狀犲狅犮犪犾犲犱狅狀犻犮 ……………………………………………… ３ｂ．内、外稃表面具钩状乳突且周围具疣粒疣粒野稻犗．犵狉犪狀狌犾犪狋犪 ……………………………………… ４ａ．不孕外稃针状或刚毛状５ ………………………………………………………………………………… ４ｂ．不孕外稃线形或线状披针形７ …………………………………………………………………………… ５ａ．一年生，植株矮小，小穗窄于１．６ｍｍ短花药野稻犗．犫狉犪犮犺狔犪狀狋犺犪 …………………………………… ５ｂ．多年生，植株高大