书书书犐 犆 犛７ １．０ ４ ０．４ ０犅４ ０ 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜５ １ ２ １—２ ０ １ ９ 进出口食用动物 、饲料中伊维菌素残留测定液相色谱 质谱／质谱法 犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犐 狏 犲 狉 犿 犲 犮 狋 犻 狀狉 犲 狊 犻 犱 狌 犲 犻 狀犾 犻 狏 犲犪 狀 犻 犿 犪 犾犪 狀 犱犳 犲 犲 犱犳 狅 狉犻 犿狆狅 狉 狋犪 狀 犱犲 狓 狆狅 狉 狋—犔 犆  犕 犛／犕 犛犿 犲 狋 犺 狅 犱 ２ ０ １ ９０ ９０ ３发布 ２ ０ ２ ００ ３０ １实施 中华人民共和国海关总署 发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　本标准是照按 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利 ，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口 。本标准起草单位 ：中华人民共和国重庆海关 。本标准主要起草人 ：李光满、夏明星、陈宗祥、唐璜、王安良、郑小玲、熊英、周树予、李应国。 Ⅰ犛 犖／犜５ １ ２ １—２ ０ １ ９ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.进出口食用动物 、饲料中伊维菌素残留测定液相色谱 质谱／质谱法 １　范围 本标准规定了进出口食用动物 、饲料中伊维菌素残留测定 液相色谱 质谱／质谱法。本标准适用于进出口食用动物 （如猪、牛、羊、兔、鸡、鸭）血液以及动物饲料中伊维菌素的测定和确证。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２分析实验室用水规格和试验方法 ３　原理 试样经乙腈涡旋振荡提取后 ，液相色谱 质谱／质谱法检测和确证 ，内标峰面积法定量 。 ４　试剂材料 除非另有说明 ，所用试剂均为分析纯 ，水为Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２规定的一级水 。 ４．１　乙腈：高效液相色谱级 。 ４．２　甲酸。 ４．３　乙酸铵。 ４．４　氯化钠。 ４．５　５ｍｍ ｏ ｌ／Ｌ乙酸铵＋０． １％甲酸水溶液 ：称取０． ３ ８ ５ｇ乙酸铵于烧杯中 ，用水溶解 ，转移至１０ ０ ０ｍＬ容量瓶中 ，用水洗涤烧杯至少 ３次，直至洗净 ，并将洗液全部转移至 １０ ０ ０容量瓶中 ，再加入１ｍＬ甲酸于１０ ０ ０ｍＬ 容量瓶中 ，用水定容 。 ４．６　标准物质 ：伊维菌素 （Ｉ ｖ ｅ ｒ ｍ ｅ ｔ ｉ ｎ ｅ ，ＣＡ Ｓ号：７ ０ ２ ８ ８  ８ ６  ７ ） ，纯度均大于 ９ ６％；伊维菌素同位素内标 （Ｉ ｖ ｅ ｒ ｍ ｅ ｔ ｉ ｎ  ｄ ２ ） ，纯度大于 ９ ８％。 ４．７　标准储备液 ：准确称取伊维菌素标准品 ０． １ｇ（精确到０． ０ ０ ０１ ｇ） ，用乙腈（４． １）充分溶解 ，稀释定容于１ ０ ０ｍＬ 容量瓶中 ，配制成浓度为 １ｍｇ／ｍＬ的标准储备液 ；另将伊维菌素同位素内标标准品 １ ０ｍｇ，用乙腈（４． １）充分溶解 ，稀释定容于 １ ０ｍＬ容量瓶中 ，配制成浓度为 １ｍｇ／ｍＬ的伊维菌素同位素内标标准储备液 ，最后分别将定容后的标准储备液倒入棕色试剂瓶中 ，－１ ８℃以下避光保存 。 ４．８　标准中间储备液 ：准确移取 １ ０ ０μＬ伊维菌素标准储备液 （４． ７）和１ ０ ０μＬ伊维菌素内标标准储备液 （４． ７）于两个１ ０ ０ｍＬ 容量瓶中 ，用乙腈稀释定容 ，分别配成 １μ／ｍＬ的伊维菌素标准中间储备液和 １μｇ／ｍＬ伊维菌素同位素内标标准中间储备液 ，溶液置于棕色试剂瓶中 ，－１ ８℃以下避光保存 。 ４．９　含内标的标准工作液 ：根据需要用乙腈 （４． １）将伊维菌素标准中间储备液 （４． ８）稀释成合适的浓度的混合标准工作曲线溶液 ，同时每个标液里面添加等量伊维菌素同位素内标标准中间储备液标准中间 １犛 犖／犜５ １ ２ １—２ ０ １ ９ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.储备液（４． ８） ，每个标液中伊维菌素同位素内标浓度为 ２ ０μｇ／Ｌ，伊维菌素浓度参考线性浓度范围为 ５μｇ／Ｌ～５ ０μｇ／Ｌ，临用时现配 。 ４．１ ０　基质标准工作液 ：选择不含伊维菌素的样品 ５份，按照本标准 ７． １进行处理至 “取上清液 ５ｍＬ氮气吹干”（不用添加伊维菌素内标 ） ，分别加入 １ｍＬ不同浓度含内标的标准工作液 （４． ９） ，超声溶解残渣，过０． ２ ２μｍ滤膜（４． １ １）后，配置成基质标准工作液 ，临用时现配 。 ４．１ １　微孔滤膜 ：有机系，０． ２ ２μｍ。 ５　仪器与设备 ５．１　液相色谱 质谱／质谱仪：配电喷雾离子源 （Ｅ Ｓ Ｉ） 。 ５．　天平：感量为０． ０ ０ ０１ ｇ和０． ０ １ｍｇ。 ５．３　冷冻离心机 ：转速不低于 ８０ ０ ０ｒ／ｍ ｉ ｎ。 ５．４　旋涡混匀器 。 ５．５　超声波清洗器 。 ５．６　氮吹仪。 ６　试样制备与保存 ６．１　试样制备 ６．１．１　饲料：从所取样品中取出具有代表性样品适量 ，磨碎混匀后 ，装入洁净的塑料袋中 ，样品数量 １ ５ｇ，密封，并标记。 ６．１．２　血液：动物血液用肝素钠抗凝采血管收集 ，样品数量 １ ５ｍＬ，密封，并标记。 ６．２　试样保存 饲料常温保存 ，待检血液试样于 ４℃保存，留存血液试样于 －１ ８℃冷冻保存 。 ７　分析步骤 ７．１　提取 ７．１．１　血液 称取２． ０ｇ（精确到０． ０ １ｇ）试样和０． ５ｇ氯化钠（４． ４）于５ ０ ｍＬ离心管中 ，加入４ ０μＬ的伊维菌素同位素内标中间储备液 （４． ８，相当于伊维菌素同位素内标质量为 ４ｎｇ） 、３ｍＬ水和１ ０ｍＬ乙腈（４． １） ，旋涡混匀２ｍ ｉ ｎ，振荡提取 ３ ０ｍ ｉ ｎ，以８０ ０ ０ｒ／ｍ ｉ ｎ在１ ０℃以下条件冷冻离心 ５ｍ ｉ ｎ，取上清液 ５ｍＬ氮气吹干，加入１． ０ｍＬ 乙腈（４． １） ，超声溶解残渣 ，过０． ２ ２μｍ滤膜（４． １ １）后，供液相色谱 质谱／质谱仪测定和确证。 ７．１．２　饲料 称取２． ０ｇ（精确到０． ０ １ｇ）试样和３． ０ｇ氯化钠（４． ４）于５ ０ｍＬ离心管中 ，加入４ ０μＬ的伊维菌素同位素内标中间储备液 （４． ８，相当于伊维菌素同位素内标质量为 ４ｎｇ） 、７． ５ｍＬ 水和１ ０ｍＬ乙腈（４． １） ，旋涡混匀２ｍ ｉ ｎ，振荡提取 ３ ０ｍ ｉ ｎ，以８０ ０ ０ｒ／ｍ ｉ ｎ在１ ０℃以下条件冷冻离心 ５ｍ ｉ ｎ，取上清液 ５ｍＬ氮气吹干，加入１． ０ｍＬ 乙腈（４． １） ，超声溶解残渣 ，过０． ２ ２μｍ滤膜（４． １ １）后，供液相色谱 质谱／质谱仪测定和确证。 ２犛 犖／犜５ １ ２ １—２ ０ １ ９ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.７．２　测定和确证 ７．２．１　液相色谱 质谱／质谱参考条件 ７．２．１．１　液相色谱参考条件 参考条件如下 ： ａ）　色谱柱：Ｃ１ ８柱，１ ０ ０ｍｍ×４． ６ｍｍ （内径） ，２． ６μｍ，或相当者 。 ｂ）　流动相：Ａ：５ｍｍ ｏ ｌ／Ｌ乙酸铵＋０． １％甲酸水溶液 （４． ５） ；Ｂ：乙腈（４． １） ，梯度洗脱程序见表 １。 ｃ）　流速：０． ４ｍＬ／ｍ ｉ ｎ。 ｃ）　柱温：３ ０℃。 ｄ）　进样量：２ ０μＬ。 表１　流动相及梯度洗脱程序 时间（ｍ ｉ ｎ） 流速（ｍＬ／ｍ ｉ ｎ）５ｍｍ ｏ ｌ／Ｌ乙酸铵＋０． １％甲酸水溶液（Ａ）％乙腈（Ｂ）％ ０ ０． ４ ５ ０ ５ ０ １ ０． ４ ５ ９ ５ １ ２ ０． ４ ５ ９ ５ １ ２． １ ０． ４ ５ ０ ５ ０ １ ５． ０ ０． ４ ５ ０ ５ ０ ７．２．１．２　质谱参考条件 参考条件如下 ： ａ）　离子源：电喷雾离子源 （Ｅ Ｓ Ｉ） ； ｂ）　扫描方式 ：正离子； ｃ）　监测方式 ：多反应监测 （ＭＲＭ） ； ｄ）　雾化气（Ｏ Ｓ １） 、气帘气（ＣＵＲ） 、辅助气（Ｇ Ｓ ２） 、碰撞气（ＣＡＤ）均为高纯氮气或其他合适气体 ；使用前应设置各气体流量 、离子源温度以及电喷雾电压到合适值 ，使质谱灵敏度达到检测要求 ，详细条件参见附录 Ａ； ｅ）　去簇电压 （Ｄ Ｐ） 、碰撞室入口电压 （Ｅ Ｐ） 、碰撞电压 （Ｃ Ｅ） 、碰撞室出口电压 （Ｃ Ｘ Ｐ）应优化至最佳条件，监测离子和定量离子等详细信息条件参见附录 Ａ。 ７．２．２　定量测定 根据试样中待测物的含量情况 ，配制响应值适宜的基质标准工作液进行色谱分析 ，基质标准工作液应有５个浓度水平 。基质标准工作液和待测液中伊维菌素的响应值应在仪器线性响应范围内 。如果样品中待测物含量超过标准曲线的线性范围 ，应用乙腈 （４． １）稀释至合适浓度后分析 。在上述色谱条件下伊维菌素参考保留时间为 ７． ６ ０ｍ ｉ ｎ ，伊维菌素标准溶液的多反应监测 （ＭＲＭ）色谱图参见图 Ｂ． １。 ７．２．３　定性分析 按照液相色谱 质谱／质谱条件测定试样和基质标准工作液 ，如果试样中待测物质的保留时间与标准品一致 ，保留时间偏差在 ５％之内；定性离子对的相对丰度是用相对于最强离子丰度的强度百分比表 ３犛 犖／犜５ １ ２ １—２ ０ １ ９ rHgCb@g · ykbûR60
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