书书书犐 犆 犛７ １．０ ４ ０．４ ０犅４ ０ 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜５ １ １ ９—２ ０ １ ９ 进出口食用动物中新霉素药物残留测定酶联免疫吸附法和液相色谱 质谱／质谱法 犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳狀 犲 狅 犿 狔犮 犻 狀狉 犲 狊 犻 犱 狌 犲 狊 犻 狀犲 犱 犻 犫 犾 犲犪 狀 犻 犿 犪 犾 犳 狅 狉 犻 犿 狆狅 狉 狋犪 狀 犱犲 狓 狆狅 狉 狋—犈 犔 犐 犛 犃犪 狀 犱犔 犆  犕 犛 ／犕 犛 ２ ０ １ ９０ ９０ ３发布 ２ ０ ２ ００ ３０ １实施 中华人民共和国海关总署 发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　本标准按照 Ｇ Ｂ／Ｔ １． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。请注意本文件的某些内容可能涉及专利 ，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口 。本标准主要起草单位 ：中华人民共和国青岛海关 。本标准主要起草人 ：孙明君、邱芳、张金玲、郑小龙、张晓文、梁成珠、孙涛、岳志芹、朱来华、王群。 Ⅰ犛 犖／犜５ １ １ ９—２ ０ １ ９ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.进出口食用动物中新霉素药物残留测定酶联免疫吸附法和液相色谱 质谱／质谱法 １　范围 本标准规定了进出口食用动物的血浆 、尿液中新霉素残留的酶联免疫吸附测定方法和液相色谱质谱联用测定方法 。本标准适用于进出口食用动物猪 、牛、羊血液及尿液中新霉素残留量的快速检测 。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２—２ ０ ０ ８　分析实验室用水规格和试验方法 第一方法 　酶联免疫吸附法 ３　原理 基于竞争性酶联免疫反应 ，含有新霉素的抗原包被于微孔板上 。药物分析时 ，样品同特异性一抗共同被添加到板孔中 。如果样品中含有药物 ，会竞争一抗 ，抑制抗体与板上包被的药物抗原结合 。加入酶标记二抗 ，形成包被抗原 抗体酶标二抗复合物 。加入底物后 ，产物的颜色强弱与样品中药物的浓度成反比。 ４　试剂与材料 ４．１　水：Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２—２ ０ ０ ８中规定的二级水 ４．２　碳二亚胺 ：分析级 ４．３　卵清蛋白 ４．４　牛血清白蛋白 ４．５　透析袋 ４．６　包被缓冲液 ４．７　洗涤缓冲液 ４．８　封闭缓冲液 ４．９　稀释缓冲液 ４．１ ０　样品提取液 ４．１ １　辣根过氧化物酶标记偶联物稀释液 ４．１ ２　底物液 ４．１ ３　显色剂液 １犛 犖／犜５ １ １ ９—２ ０ １ ９ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.４．１ ４　终止液 ４．１ ５　抗体 ４．１ ６　ＨＲ Ｐ偶联物 ４．１ ７　包被卵清蛋白偶联新霉素的聚苯乙烯微量 ９ ６孔反应板 ４．１ ８　标准品：硫酸新霉素 ，纯度９ ０％。 ４．１ ９　标准品贮备液 ：准确称取标准品 ，折合成目标化合物 １ ０． ０ｍｇ，用适量水溶解 ，并用水定容至 １ ０ｍＬ，混匀。－１ ８℃以下避光保存 ，有效期为 １ ２个月。 ４．２ ０　标准品中间液 ：用水稀释标准储备液至 １ ０ｍｇ／Ｌ，４℃以下避光保存 ，有效期为 ６个月。 ４．２ １　标准品工作液 ：用稀释缓冲液稀释标准中间液至工作浓度 １． ５μｇ／Ｌ、３μｇ／Ｌ、６μｇ／Ｌ、１ ２μｇ／Ｌ、 ３ ６μｇ／Ｌ，现用现配 。 注：４试剂与材料所涉及各种液体配制详见附录 Ａ ５　仪器和设备 ５．１　分析天平 ，感量０． ０ ０ ０１ ｇ。 ５．２　酶标仪，带有４ ５ ０ｎ ｍ 滤光片。 ５．３　离心机：转数≥８０ ０ ０ｒ／ｍ ｉ ｎ。 ５．４　超声波发生器 。 ５．５　微量移液器 ：单道２ ０μＬ、５ ０μＬ、１ ０ ０μＬ和多道５ ０  ３ ５ ０μＬ。 ５．６　酸度计：ｐＨ测量范围 ０  １ ４。 ５．７　涡旋式混合器 。 ５．８　振荡器。 ６　测定步骤 ６．１　试样制备与保存 ６．１．１　试样制备 分别采集动物血液 １ ０ｍＬ于含有肝素钠的抗凝试管中 、新鲜尿液 ５ ０ｍＬ装入洁净容器内 ，各分成两等份，作为试样密封并标明标记 。在制样操作过程中 ，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。 ６．１．２　试样保存 试样置于 ４℃下可保存 ３  ４天；若长期保存 ，需将试样置于 －１ ８℃以下。 ６．２　提取 取５ ０μＬ样品，加１． ２ｍＬ 样品提取液 ，混匀，４０ ０ ０×ｇ离心５ｍ ｉ ｎ，上清液用于检测 。 ６．３　酶联免疫测定 ６．３．１　根据待测样品数量和标准样品 （每个样品 ２个平行） ，决定微孔的使用量 。 ６．３．２　每孔加入 １ ０ ０μＬ含有卵清蛋白偶联新霉素抗原包被板 ４℃过夜。 ６．３．３　将微孔内液体垂直倒掉 ，加入２ ５ ０μＬ洗涤缓冲液 ，轻轻晃动后垂直倒掉 ，再重复洗涤微孔 ３次，在滤纸上用力垂直磕掉残留在壁上的液体 。 ２犛 犖／犜５ １ １ ９—２ ０ １ ９ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.６．３．４　每孔加２ ５ ０μＬ２％牛血清白蛋白 ，３ ７℃封闭２小时。 ６．３．５　操作同６． ３． ３。 ６．３．６　每个微孔中加入 ５ ０μＬ标准溶液或待测样品溶液 。 ６．３．７　在每个微孔中加入 ５ ０μＬ辣根酶标记物和 ５ ０μＬ抗体，混匀。 ６．３．８　室温（２ ０  ２ ５）℃避光孵育 ３ ０ｍ ｉ ｎ。 ６．３．９　操作同６． ３． ３。 ６．３．１ ０　每个微孔加入 ５ ０μＬ底物液和 ５ ０μＬ显色剂液 ，充分混合并在室温 （２ ０  ２ ５）℃暗处孵育 １ ５ｍ ｉ ｎ。 ６．３．１ １　加入１ ０ ０μＬ的终止液终止反应 ，充分混合后 ３ ０ｍ ｉ ｎ 内于４ ５ ０ｎ ｍ 处测量吸光度值 。 ６．４　空白试验 除不加试样外 ，均按６． ３测定步骤进行 。 ６．５　质控试验 每次测定均应做一个用空白样品添加药物混合标样的质控样品 ，添加浓度应为相应产品的检测低限。 ７　结果计算 ７．１　标准曲线的绘制 将６个浓度的标准溶液 （０ｎｇ／ｍＬ、１． ５ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、１ ２ｎｇ／ｍＬ、３ ６ｎｇ／ｍＬ）和待测溶液按限量法测定步骤测定得相应的吸光度值 。以０浓度的吸光度 Ａ０值为分母 ，其他标准浓度的吸光度Ａ值为分子的比值 ，再乘以１ ０ ０，获得吸光度的百分比 。以此吸光度百分比为纵坐标 ，对应的５个标准浓度为横坐标 ，在半对数坐标上绘制标准曲线 。该定标模型在 １． ５ｎｇ／ｍＬ  ３ ６ｎ ｇ／ｍＬ范围内是线性的。 ７．２　百分吸光度值的计算 按式（１）计算百分吸光度值 ： 百分吸光度值 ＝Ｂ样品Ｂ０×１ ０ ０％ …………………………（ １） 　　Ｂ样品— — —样品孔的平均吸光度值 ； Ｂ０— — —零标准的平均吸光度值 。 ７．３　待测溶液中目标物含量的计算 将样本的百分吸光度值代入标准曲线中 ，从标准曲线上得到相应的药物浓度 ｃ（μｇ／Ｌ） ，按式（２）计算血浆和尿液中新霉素药物的残留量 。 Ｘ＝ｃ·ｆ …………………………（ ２） 　　式中： Ｘ— — —试样中药物残留量 ，单位为微克 ／升（μｇ／Ｌ） ； ｃ— — —从标准曲线中得到的试样中药物含量 ，单位为微克 ／升（μｇ／Ｌ） ； ｆ— — —试样稀释倍数 ；计算结果保留三位有效数字 。阳性结果需要经过 Ｌ Ｃ  ＭＳ／ＭＳ方法进行确认 。 ３犛 犖／犜５ １ １ ９—２ ０ １ ９ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.８　方法性能指标 ８．１　灵敏度 本方法在检测猪 、牛、羊的血液和尿液样本中检测限为 ４ ０ｎｇ／ｍＬ。 ８．２　回收率 本方法在 １． ５ｎｇ／ｍＬ  ３ ６ｎ ｇ／ｍＬ添加浓度水平上的回收率为 ８ ０％  ９ ５％ 。 ８．３　精密度 对于定量分析 ，每个试样最少应取两份平行样进行分析 。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 ２ ０％。 注：可使用经合格评定的等效的商品化 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ试剂盒检测 。 第二方法 　液相色谱串联质谱方法 ９　试剂材料 ９．１　水：Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２规定的一级水 。 ９．２　甲醇：色谱级。 ９．３　乙腈：色谱级。 ９．４　磷酸：优级纯。 ９．５　甲酸：色谱级。 ９．６　甲酸铵：色谱级。 ９．７　庚烷磺酸钠 ：色谱纯。 ９．８　磷酸三钠 ：分析纯。 ９．９　提取液１：磷酸盐缓冲液 （含５ ０ｍＭ 庚烷磺酸钠 、２ ５ｍＭ 磷酸三钠 ） ，磷酸调ｐＨ＝２． ０。 ９．１ ０　提取液２：磷酸盐缓冲液 （含５ ０ｍＭ 庚烷磺酸钠 、２ ５ｍＭ 磷酸三钠 ） 。 ９．１ １　Ｓ Ｐ Ｅ柱：Ｂ ＡＫＥ Ｒ ＢＯＮＤ ｓ ｐｅＯ ｃ ｔ ａ ｅ ｃ ｙｌＣ１ ８。 １ ０　仪器和设备 １ ０．１　液相色谱 质谱串联仪 ：配有电喷雾离子源 ，Ａ Ｂ公司。 １ ０．２　均质器：Ｔ ２ ５１ ８ Ｇ ，Ｉ ＫＡ公司。 １ ０．３　涡旋混匀器 。 １ ０．４　ｐＨ计：ＰＨＳ  ３ Ｃ ，梅特勒。 １ ０．５　高速冷冻离心机 ：Ｈ Ｉ ＴＡＣＨ ＩＣ Ｒ ２ １ Ｇ Ⅲ。 １ ０．６　固相萃取