书书书犐 犆 犛７ １．０ ４ ０．４ ０犅４ ０ 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜５ １ １ ８—２ ０ １ ９ 进出口食用动物 、饲料中三聚氰胺残留测定液相色谱 质谱／质谱法 犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犿 犲 犾 犪 犿 犻 狀 犲狉 犲 狊 犻 犱 狌 犲 狊 犻 狀犾 犻 狏 犲犪 狀 犻 犿 犪 犾犪 狀 犱犳 犲 犲 犱犳 狅 狉 犻 犿 狆狅 狉 狋犪 狀 犱犲 狓狆狅 狉 狋—犔 犆  犕 犛／犕 犛犿 犲 狋 犺 狅 犱 ２ ０ １ ９０ ９０ ３发布 ２ ０ ２ ００ ３０ １实施 中华人民共和国海关总署 发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　本标准按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。请注意本文件的某些内容可能涉及专利 ，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口 。本标准起草单位 ：中华人民共和国重庆海关 、中华人民共和国南京海关 。本标准主要起草人 ：夏明星、李光满、陈宗祥、王凯民、吴杰、唐柏彬、王昱、胡硕、李应国。 Ⅰ犛 犖／犜５ １ １ ８—２ ０ １ ９ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.进出口食用动物 、饲料中三聚氰胺残留测定液相色谱 质谱／质谱法 １　范围 本标准规定了进出口食用动物 、饲料中三聚氰胺残留量液相色谱 质谱／质谱检测方法 。本标准适用于进出口食用动物 （如猪、牛、羊、兔、鸡、鸭）血液、尿液以及动物饲料中三聚氰胺的测定和确证。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２　分析实验室用水规格和试验方法 Ｇ Ｂ／Ｔ１ ４ ６ ９ ９． １ 　饲料　采样 Ｇ Ｂ／Ｔ２ ０ １ ９ ５ 　动物饲料 　试样的制备 ３　方法提要 试样经酸性甲醇水溶液超声提取后 ，经混合阳离子固相萃取柱净化 ，液相色谱 质谱／质谱法检测和确证，内标法定量 。 ４　试剂材料 除非另有说明 ，所用试剂均为分析纯 ，水为Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２规定的一级水 。 ４．１　甲醇：高效液相色谱级 。 ４．２　乙腈：高效液相色谱级 。 ４．３　乙酸：高效液相色谱级 。 ４．４　乙酸铵 ４．５　５ ０％甲醇水溶液 （５＋５，Ｖ／Ｖ） ：量取５ ０ ０ｍＬ 甲醇和５ ０ ０ｍＬ 水，混匀。 ４．６　９ ５％乙腈水溶液 ：取５ ０ｍＬ水与９ ５ ０ｍＬ 乙腈混匀 。 ４．７　５％乙酸溶液 ：取５ｍＬ乙酸溶于 ９ ５ｍＬ水中。 ４．８　５％氨水甲醇 ：取５ｍＬ氨水溶于 ９ ５ｍＬ甲醇中。 ４．９　酸性甲醇提取液 ：９ ９ ０ｍＬ５ ０％ 甲醇水溶液 （４． ５）中加１ ０ｍＬ乙酸混匀 。 ４．１ ０　５ｍｍ ｏ ｌ／Ｌ乙酸铵溶液 ：称取０． ３ ８ ５ｇ乙酸铵溶于 １０ ０ ０ｍＬ 水中。 ４．１ １　标准物质 ：三聚氰胺 （Ｍ ｅ ｌ ａ ｍ ｉ ｎ ｅ ，ＣＡ Ｓ号：１ ０ ８  ７ ８  １ ） 、三聚氰胺同位素内标 （１ ５ Ｎ ３  Ｍ ｅ ｌ ａ ｍ ｉ ｎ ｅ ，ＣＡ Ｓ号：２ ８ ７ ４ ７ ６  １ １  ３ ） ，纯度均大于 ９ ８％。 ４．１ ２　标准储备液 ：准确称取三聚氰胺标准品 ０． １ｇ（精确到０． ０ ０ ０１ ｇ） ，用５ ０％甲醇水溶液 （４． ５）充分溶解，稀释定容于 １ ０ ０ｍＬ 容量瓶中 ，配制成浓度为 １． ０ ０ｍｇ／ｍＬ的标准储备溶液 ，将三聚氰胺同位素内标标准品 １ｍｇ，用５ ０％甲醇水溶液 （４． ５）充分溶解 ，稀释定容于 １ ０ｍＬ 容量瓶中 ，配制成浓度为 １犛 犖／犜５ １ １ ８—２ ０ １ ９ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.０． １ ０ ０ｍ ｇ／ｍＬ的标准储备溶液 ，分别将定容后的标准储备液倒入棕色试剂瓶中 ，－１ ８℃以下避光保存 。 ４．１ ３　标准中间储备液 ：准确移取 １ ０ ０μＬ三聚氰胺标准储备液 （４． １ ２）和１ ０ ０μＬ三聚氰胺内标标准储备液（４． １ ２）于两个１ ０ ０ｍＬ 容量瓶中 ，用乙腈稀释定容 ，分别配成 １． ０ ０μｇ／ｍＬ的三聚氰胺标准溶液和 ０． １ ０ ０μｇ／ｍＬ三聚氰胺同位素内标标准溶液 ，该溶液置于棕色试剂瓶中 ，－１ ８℃以下避光保存 。 ４．１ ４　标准工作液 ：根据需要用 ９ ５％乙腈水溶液 （４． ６）将标准中间储备液 （４． １ ３）稀释成合适浓度的混合标准工作曲线溶液 ，参考线性浓度范围为 ５ｎｇ／ｍＬ～１ ０ ０ｎｇ／ｍＬ，三聚氰胺同位素内标浓度为 ２ｎｇ／ｍＬ临用时现配 。 ４．１ ５　ＭＣ Ｘ固相萃取柱 （６ ０ｍｇ，３ｍＬ）１）或相当者 ：使用前依次用 ３ｍＬ甲醇、３ｍＬ水和３ｍＬ５％ 乙酸溶液（４． ７）活化。 ４．１ ６　微孔滤膜 ：有机系，０． ２ ２μｍ。 ５　仪器与设备 ５．１　液相色谱 质谱／质谱仪：配电喷雾离子源 （Ｅ Ｓ Ｉ） 。 ５．２　天平：感量为０． ０ ０ ０１ ｇ和０． ０ １ｍｇ。 ５．３　离心机：转速不低于 ８０ ０ ０ｒ／ｍ ｉ ｎ。 ５．４　旋涡混匀器 。 ５．５　超声清洗器 。 ５．６　固相萃取装置 。 ５．７　氮吹仪。 ６　试样制备与保存 ６．１　试样采集制备 ６．１．１　饲料：按照Ｇ Ｂ／Ｔ１ ４ ６ ９ ９． １ 采集代表性样品 ，按照Ｇ Ｂ／Ｔ２ ０ １ ９ ５ 制备。 ６．１．２　血液：动物血液用肝素钠抗凝采血管收集 ，采集数量不得少于 １ ０ｍＬ，密封，并表明标记 。 ６．１．３　尿液：用洁净的离心管收集 ，采集数量不得少于 １ ０ｍＬ，充分搅拌均匀后 ，密封，并标明标记 。 ６．２　试样保存 饲料样品常温保存 ，待检血液和尿液试样于 ４℃保存，留存血液和尿液试样于 －１ ８℃冷冻保存 。 ７　分析步骤 ７．１　提取 称取２ｇ（精确到０． ０ １ｇ）试样于５ ０ｍＬ离心管中 ，分别加入 ４ ０μＬ的三聚氰胺同位素内标溶液 （４． １ ３，相当于三聚氰胺同位素内标质量为 ４ｎｇ）和２ ０ｍＬ酸性甲醇提取液 （４． ９）旋涡混匀 ２ｍ ｉ ｎ，超声提取１ ０ｍ ｉ ｎ，以８０ ０ ０ｒ／ｍ ｉ ｎ１ ０℃ 冷冻离心 ５ｍ ｉ ｎ，取上清液 １ ０ｍＬ转移至１ ５ｍＬ试管中，待净化。 １）　ＭＣ Ｘ固相萃取柱为 Ｗａ ｔ ｅ ｒ ｓ公司生产 ，给出这一条信息是为了给本标准使用者提供方便 ，而不是标准管理部门 对这一产品的认可 。 ２犛 犖／犜５ １ １ ８—２ ０ １ ９ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.７．２　净化 将待净化液转移至活化后的 ＭＣ Ｘ固相萃取柱 （４． １ ５）中，流速不能超过 １滴／ｓ，用３ｍＬ水润洗装 样液的离心管并过柱 ，再用３ｍＬ甲醇（４． １）淋洗小柱 ，最后用３ｍＬ５％ 氨水甲醇溶液 （４． ８）洗脱，收集洗脱液，于４ ０℃下氮气吹干 ，用１． ０ｍＬ９ ５％ 乙腈水溶液 （４． ６）充分溶解残渣 ，过０． ２ ２μｍ滤膜（４． １ ６）后，供液相色谱 质谱／质谱仪测定和确证 。 ７．３　测定和确证 ７．３．１　液相色谱 质谱／质谱参考条件 ７．３．１．１　液相色谱参考条件 参考条件如下 ： ａ）　色谱柱：Ｈ Ｉ Ｌ Ｉ Ｃ柱，１ ０ ０ｍｍ×２． １ｍｍ （内径） ，３μｍ，或相当者 。 ｂ）　流动相：Ｂ：５ｍｍ ｏ ｌ／Ｌ乙酸铵溶液 （４． １ ０） ：Ａ：乙腈（４． ２） ，梯度洗脱程序见表 １。 ｃ）　流速：０． ４ｍＬ／ｍ ｉ ｎ。 ｃ）　柱温：４ ０℃。 ｄ）　进样量：５μＬ。 表１　流动相及梯度洗脱程序 时间（ｍ ｉ ｎ） 流速（ｍＬ／ｍ ｉ ｎ） ５ｍｍ ｏ ｌ／Ｌ乙酸铵溶液 （Ａ）％ 乙腈（Ｂ）％ ０ ０． ４ ５ ９ ５ １ ０． ４ ５ ９ ５ ４ ０． ４ ４ ０ ６ ０ ６ ０． ４ ４ ０ ６ ０ ６． １ ０． ４ ５ ９ ５ １ ０ ０． ４ ５ ９ ５ ７．３．１．２　质谱参考条件 参考条件如下 ： ａ）　离子源：电喷雾离子源 （Ｅ Ｓ Ｉ） ： ｂ）　扫描方式 ：正离子； ｃ）　监测方式 ：多反应监测 （ＭＲＭ） ； ｄ）　雾化气（Ｇ Ｓ ｌ） 、气帘气（ＣＵＲ） 、辅助气（Ｇ Ｓ ２） 、碰撞气（ＣＡＤ）均为高纯氮气或其他合适气体 ；使用前应设置各气体流量 、离子源温度以及电喷雾电压到合适值 ，使质谱灵敏度达到检测要求 ，详细条件参见附录 Ａ； ｅ）　去簇电压 （Ｄ Ｐ） 、碰撞室入口电压 （Ｅ Ｐ） 、碰撞电压 （Ｃ Ｅ） 、碰撞室出口电压 （Ｃ Ｘ Ｐ）应优化至最佳条件，监测离子和定量离子等详细信息条件参见附录 Ａ。 ７．３．２　定量测定 根据试样中待测物的含量情况 ，配制响应值适宜的标准工作液进行色谱分析 ，标准曲线工作液应有 ５个浓度水平 ，应包括零点 。标准工作液和待测液中三聚氰胺的响应值应在仪器线性响应范围内 。如 ３犛 犖／犜５ １ １ ８—２ ０ １ ９ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.果样品中待测物含量超过标准曲线的线性范围 ，用９ ５％乙腈水溶液 （４． ６）稀释至合适浓度后分析 。在上述色谱条件下三聚氰胺保留时间为 ２． ８ ０ｍ ｉ ｎ