书书书犐 犆 犛６ ５．０ ２ ０犅４ ３ 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜５ １ １ ３—２ ０ １ ９ 进出口食用动物 、饲料中呋喃测定液相色谱 质谱／质谱法和液相色谱法 犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳狀 犻 狋 狉 狅 犳 狌 狉 犪 狀犪 狀 狋 犻 犫 犻 狅 狋 犻 犮 狊 犻 狀犲 犱 犻 犫 犾 犲犪 狀 犻 犿 犪 犾 狊犪 狀 犱犳 犲 犲 犱 狊犳 狅 狉犻 犿狆狅 狉 狋犪 狀 犱犲 狓 狆狅 狉 狋—犔 犆  犕 犛／犕 犛犿 犲 狋 犺 狅 犱 、犔 犆犿 犲 狋 犺 狅 犱 ２ ０ １ ９０ ９０ ３发布 ２ ０ ２ ００ ３０ １实施 中华人民共和国海关总署 发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　本标准依据 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９要求的规则起草 。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口 。本标准起草单位 ：中华人民共和国天津海关 。本标准主要起草人 ：赵祥平、王飞、柴铭骏、李淑静、杨爽、张俊哲、赵丹、刘洋。 Ⅰ犛 犖／犜５ １ １ ３—２ ０ １ ９ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.进出口食用动物 、饲料中呋喃测定液相色谱 质谱／质谱法和液相色谱法 １　范围 本标准规定了进出口食用动物血清 、尿液中硝基呋喃代谢物的液相色谱 质谱／质谱测定方法和饲料中呋喃的液相色谱测定方法 。本标准适用于进出口动物血清 （牛、猪、鸡） 、尿液（牛、猪）中硝基呋喃代谢物的测定 ，饲料（配合饲料、预混合饲料 、浓缩饲料 ）中呋喃的测定 。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２　分析实验室用水规格和试验方法 （ｎ ｅｑＩ Ｓ Ｏ３ ６ ９ ６ ：１ ９ ８ ７，ＭＯＤ） ３　方法原理 血样、尿样样品中的硝基呋喃代谢物 ，前处理采用在酸性条件下进行水解 ，同时用２ 硝基苯甲醛进行过夜衍生化 ，经乙酸乙酯溶液提取后 ，用液相色谱 质谱／质谱法测定 ，内标法进行定量 。饲料样品中的呋喃 ，前处理采用乙腈提取 ，浓缩定容后 ，用液相色谱法测定 ，外标法进行定量 。 ４　试剂和材料 除另有说明外 ，所用水为 Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２规定的一级水 。 ４．１　甲醇、乙腈、乙酸乙酯 、正己烷、甲酸：色谱纯。 ４．２　２ 硝基苯甲醛 、三水合磷酸氢二钾 ：分析纯。 ４．３　乙酸铵：色谱纯。 ４．４　二甲基亚砜 ：分析纯。 ４．５　标准物质 ：呋喃西林原药 （ＣＡ Ｓ编码５ ９  ８ ７  ０，分子量１ ９ ８． １ ４，分子式Ｃ６Ｈ６Ｎ４Ｏ４） 、呋喃唑酮原药 （ＣＡ Ｓ编码６ ７  ４ ５  ８，分子量２ ２ ５． １ ６，分子式Ｃ８Ｈ７Ｏ５Ｎ３） 、呋喃他酮原药 （ＣＡ Ｓ编码１ ３ ９  ９ １  ３ ，分子量 ３ ２ ４． ３ ３，分子式Ｃ１ ３Ｈ１ ６Ｎ４Ｏ６） 、呋喃妥因原药 （ＣＡ Ｓ编码６ ７  ２ ０  ９，分子量２ ３ ８． １ ６，分子式Ｃ８Ｈ６Ｎ４Ｏ５）标准物质，纯度≥９ ８％。 ４．６　标准物质 ：呋喃西林代谢物 （ＣＡ Ｓ编码５ ７  ５ ６  ７，分子量７ ５． ０ ７，分子式ＣＨ５Ｎ３Ｏ） 、呋喃唑酮代谢物 （ＣＡ Ｓ编码８ ０  ６ ５  ９，分子量１ ０ ２． ０ ９，分子式Ｃ３Ｈ６Ｎ２Ｏ２） 、呋喃他酮代谢物 （ＣＡ Ｓ编码４ ３ ０ ５ ６  ６ ３  ９ ，分子量２ ０ １． ２ ２，分子式 Ｃ８Ｈ１ ５Ｎ３Ｏ３） 、呋喃妥因代谢物 （ＣＡ Ｓ编码２ ８ ２ ７  ５ ６  ７ ，分子量１ ５ １． ５ ５，分子式 Ｃ３Ｈ６Ｃ Ｉ Ｎ３Ｏ２）标准物质 ，纯度≥９ ８％。 ４．７　１ｍ ｏ ｌ／Ｌ盐酸溶液的配制 ：移取浓盐酸 １ ６． ９ｍＬ ，用水定容至 ２ ０ ０ｍ ｌ。 ４．８　０． １ｍ ｏ ｌ／ＬＫ２ＨＰ Ｏ ４溶液的配制 ：称取Ｋ２ＨＰ Ｏ ４·３Ｈ２Ｏ１ １． ４ｇ，以水溶解 ，定容至５ ０ ０ｍＬ 。 ４．９　５ｍ ｏ ｌ／Ｌ的Ｎ ａ ＯＨ溶液的配制 ：称取Ｎ ａ ＯＨ１ ０ ０ ｇ，以水溶解 ，定容至５ ０ ０ｍＬ 。 １犛 犖／犜５ １ １ ３—２ ０ １ ９ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.４．１ ０　衍生化试剂的配制 ：３ ７． ８ｍｇ２ 硝基苯甲醛溶于 ５ｍ ｌ二甲基亚砜 ，现用现配 。 ４．１ １　１ ０％乙腈水溶液：量取１ ０ｍＬ乙腈与９ ０ｍＬ水，混匀。 ４．１ ２　２％甲酸：量取２ｍＬ甲酸与９ ８ｍＬ水，混匀。 ４．１ ３　甲醇－０． ５ｍｍ ｏ ｌ ／Ｌ乙酸铵溶液 （２ ０∶８ ０ ，Ｖ／Ｖ） ：称取３ ８． ５ｍｇ乙酸铵，用水稀释并定容至 ８ ０ ０ｍＬ ，然后加入 ２ ０ ０ｍＬ 甲醇，混匀。 ４．１ ４　０． ０ ５％乙酸铵溶液 ；称取５ ０ ０ｍｇ乙酸铵，用水稀释并定容至 １Ｌ。 ４．１ ５　呋喃原药类标准储备液 ：０． １ ｍｇ／ｍＬ。准确称取适量的标准物质 （４． ５） ，用乙腈分别配成 ０． １ｍｇ／ｍＬ的标准储备溶液 ，在－１ ８℃避光保存 。 ４．１ ６　呋喃代谢物类标准储备液 ：０． １ｍｇ／ｍＬ。准确称取适量的标准物质 （４． ６） ，用甲醇分别配成 ０． １ｍｇ／ｍＬ的标准储备溶液 ，在－１ ８℃避光保存 。 ４．１ ７　呋喃原药类标准工作溶液 ：根据需要吸取标准储备溶液 （４． １ ５） ，用乙腈稀释定容至刻度 。 ４．１ ８　呋喃代谢物类标准工作溶液 ：根据需要吸取标准储备溶液 （４． １ ６） ，用甲醇稀释定容至刻度 。 ４．１ ９　滤膜：０． ２ ２μｍ，有机相滤膜 。 ５　仪器 ５．１　液相色谱 串联质谱仪 ：配有电喷雾离子源 。 ５．２　液相色谱仪 ：配有紫外检测器 。 ５．３　分析天平 ：感量０． ０ １ｇ，０． ０ ０ ０１ ｇ。 ５．４　超声波清洗器 。 ５．５　固相萃取装置 。 ５．６　氮气浓缩仪 。 ５．７　离心机：转速大于等于 ４０ ０ ０ｒ／ｍ ｉ ｎ。 ５．８　水浴恒温振荡器 。 ６　样品的制备与保存 ６．１　试样的制备 对于血样和尿样 ，取离心后上清 ，混合均匀 ，分装标记 。对于饲料样品则取代表性样品 １ｋｇ，四分法缩减，取约２ ０ ０ｇ，经粉碎，过０． ４ ５ｍｍ 孔筛，混匀分装磨口瓶 。在制样的操作过程中 ，应防止样品受到污染或发生目标物含量的变化 。 ６．２　试样的保存 将分装后的血样 、尿样试样于 －１ ８℃保存，饲料４℃冷藏。 ７　测定步骤 ７．１　提取 血样或尿样 ：解冻后，离心，取１ｇ（精确至０． ０ １ｇ）上清于１ ５ｍＬ离心管中 ，加入０． ５ｍＬ１ｍ ｏ ｌ ／Ｌ盐酸溶液（４． ７） ，０． ３ｍＬ 衍生化试剂 （４． １ ０） 。３ ７ ℃水浴振荡 １ ６小时，避光。衍生化完毕后 ，分别加入 ０． １ｍＬ５ｍ ｏ ｌ ／Ｌ的Ｎ ａ ＯＨ溶液（４． ９） ，１ｍＬ０． １ｍ ｏ ｌ ／Ｌ的Ｋ２ＨＰ Ｏ ４溶液（４． ８）和４ｍＬ的乙酸乙酯 ，涡旋３ ０ｓ，４０ ０ ０ｒ／ｍ ｉ ｎ，离心５ｍ ｉ ｎ，取出上层的乙酸乙酯层 ，备用；再向溶液中加入 ４ｍ ｌ的乙酸乙酯 ，涡旋 ２犛 犖／犜５ １ １ ３—２ ０ １ ９ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.３ ０ｓ，４０ ０ ０ｒ／ｍ ｉ ｎ，离心５ｍ ｉ ｎ，取出上层的乙酸乙酯层 ，合并乙酸乙酯层 。饲料：称取２ｇ样品（精确至０． ０ １ｇ）至５ ０ｍＬ离心管中 ，加入２ ０ｍＬ乙腈，涡旋１ｍ ｉ ｎ，超声提取 １ ５ｍ ｉ ｎ，８０ ０ ０ｒ／ｍ ｉ ｎ离心１ ０ｍ ｉ ｎ，取出上层的乙腈层 ，备用：再向饲料中加入 ２ ０ｍＬ乙腈，涡旋１ｍ ｉ ｎ， 超声提取 １ ５ｍ ｉ ｎ，８０ ０ ０ｒ／ｍ ｉ ｎ离心，１ ０ｍ ｉ ｎ，取出上层的乙腈层 ，合并乙腈层 。移取乙腈层 ４ｍＬ，Ｎ２吹干。 ７．２　净化 血样或尿样 ：Ｎ２吹干乙酸乙酯层 ，分别加入 １ｍ ｌ的１ ０％乙腈水溶液（４． １ １）复溶，涡旋３ ０ｓ，加 ３ｍＬ正己烷涡旋 ３ ０ｓ，４０ ０ ０ｒ／ｍ ｉ ｎ，离心５ｍ ｉ ｎ，取下层过 ０． ２ ２μｍ滤膜，供液相色谱 质谱／质谱测定 。饲料：加２％甲酸（４． １ ２）１ｍＬ，超声２ｍ ｉ ｎ，涡旋１ｍ ｉ ｎ使其充分溶解 ，过０． ２ ２μｍ滤膜，供液相色谱测定。按照上述步骤 ，制备样品空白提取液 ，以便配制基质系列标准工作溶液 。 ７．３　硝基呋喃代谢物的测定条件 ７．３．１　液相色谱条件 硝基呋喃代谢物的液相色谱分离条件如下 ： ａ）　色谱柱：Ｃ １ ８，１． ９μｍ，２． １×１ ０ ０ｍｍ 或性能相当者 ； ｂ）　流速：０． ３ｍＬ／ｍ ｉ ｍ； ｃ）　柱温：２ ５℃； ｄ）　进样量：５μＬ； ｅ）　流动相：甲醇－０． ５ｍｍ ｏ ｌ ／Ｌ乙酸铵溶液 （２ ０：８ ０，Ｖ／Ｖ，详见４． １ ３） 。梯度洗脱 ；梯度洗脱条件见表１。 表１　呋喃类代谢物的梯度洗脱条件 时间，ｍ ｉ ｎ甲醇－０． ５ｍｍ ｏ ｌ ／Ｌ乙酸铵溶液 （２ ０∶８ ０，Ｖ／Ｖ）甲醇 ０． ０ ０ ９ ０ １ ０ １． ０ ０ ９ ０ １ ０ ３． ０ ０ ２ ０ ８ ０ ３． ５