SN-T 5109-2019 国境口岸鼠疫耶尔森菌聚合酶螺旋恒温扩增检测方法

书书书犐犆犛１１．１００犆６２中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜５１０９—２０１９国境口岸鼠疫耶尔森菌聚合酶螺旋恒温扩增检测方法犘狅犾狔犿犲狉犪狊犲狊狆犻狉犪犾犻狊狅狋犺犲狉犿犪犾狉犲犪犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱犳狅狉犢犲狉狊犻狀犻犪狆犲狊狋犻狊犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋狊２０１９０９０３发布２０２００３０１实施中华人民共和国海关总署发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准根据ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国满洲里海关、中华人民共和国福州海关、中国人民解放军疾病预防控制研究所。本标准主要起草人：张晓龙、高艳菲、郭文秀、王静、黄恩炯、刘威、慈颖、刘丽娟、杨宇、黄留玉。 Ⅰ犛犖／犜５１０９—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.国境口岸鼠疫耶尔森菌聚合酶螺旋恒温扩增检测方法１　范围本标准规定了国境口岸检测鼠疫耶尔森菌聚合酶螺旋恒温扩增（ＰＳＲ）法，包括样本前处理、检测程序、方法、结果判定及报告。本标准适用于国境口岸鼠疫耶尔森菌疑似感染样本、啮齿动物、蚤等样本中鼠疫耶尔森菌的筛选检测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９　实验室生物安全通用要求ＷＳ２３３　微生物和生物医学实验室生物安全通用准则人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫生部）３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１鼠疫耶尔森菌　犢犲狉狊犻狀犻犪狆犲狊狋犻狊分类上属原生生物界，原核细胞型微生物，革兰氏阴性兼性厌氧菌类，肠杆菌科，耶尔森菌属，假结核耶尔森菌鼠疫亚种（犢．狆狊犲狌犱狅狋狌犫犲狉犮狌犾狅狊犻狊狆犲狊狋犻狊）。鼠疫的病原菌，能够引发腺鼠疫、败血型鼠疫和肺鼠疫，是生物战剂和生物恐怖的重要病原菌之一。Ｆ１抗原是目前公认的鼠疫菌种特异性抗原之一，其Ｆ１基因常作为鼠疫菌核酸检测的靶标。３．２聚合酶螺旋恒温扩增反应　狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲狊狆犻狉犪犾犻狊狅狋犺犲狉犿犪犾狉犲犪犮狋犻狅狀（犘犛犚）一种核酸恒温扩增方法，利用２条～４条引物来特异性识别目标片段的４个～６个独立区域，在犅狊狋ＤＮＡ聚合酶的链置换作用下，短时内扩增靶序列，形成螺旋扩增。大量合成目标ＤＮＡ的同时，伴随有ｐＨ的大幅下降，加入ｐＨ指示剂，可通过观察颜色变化判定结果；也可以加入荧光染料（例如：ＥｖｅＧｒｅｅｎ），通过荧光ＰＣＲ仪上的扩增曲线和溶解曲线来判定结果。４　缩略语下列缩略语适用于本文件。ＰＳＲ：聚合酶螺旋恒温扩增反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓｐｉｒａｌｉｓｏｔｈｅｒｍａｌｒｅａｃｔｉｏｎ）１犛犖／犜５１０９—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.ＤＮＡ：脱氧核糖核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）ｄＮＴＰ：脱氧核糖核苷三磷酸（ｄｅｏｘｙ～ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）犅狊狋酶：犅狊狋ＤＮＡ聚合酶（大片段）（ＢｓｔＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ｌａｒｇｅｆｒａｇｍｅｎｔ））５　检测对象检测对象包括： — — —国境口岸出现的不明样本和环境样本； — — —啮齿动物及寄生蚤、洞干蚤等样本； — — —国境口岸来自鼠疫疫区的有症状或其他不能排除鼠疫耶尔森菌感染的人员样本。６　生物安全要求实验过程中生物安全要求如下： — — —检测工作中按ＧＢ１９４８９和ＷＳ２３３中相关要求做好个体防护； — — —应遵循《人间传染的病原微生物名录》中的生物安全要求进行，鼠疫菌核酸检测应在生物安全二级（ＢＳＬ  ２）实验室； — — —应遵循ＧＢ１９４８９对废弃物的处理要求对废弃物品进行处理。７　主要仪器与试剂７．１　主要仪器主要仪器设备如下：荧光ＰＣＲ仪；或核酸扩增仪；或恒温扩增检测仪；或金属浴；或水浴锅：６５℃±１℃ ；９５℃±１℃ 。７．２　主要试剂使用的主要试剂如下： — — —多功能样品处理液：含５％Ｃｈｅｌｅｘ  １００，１％ＴｒｉｔｏｎＸ  １００的ＴＥ缓冲液（Ｔｒｉｓ１０ｍＭ，ＥＤＴＡ１ｍＭ）（具体配制方法参见附录Ａ）； — — —鼠疫菌螺旋恒温扩增快速检测试剂盒：包括核酸免提取试剂（多功能样品处理管１，含多功能样品处理液），鼠疫菌ＰＳＲ一滴法现场检测试剂盒２（具体方法参见附录Ｂ），鼠疫菌实时荧光ＰＳＲ检测试剂盒３（具体方法参见附录Ｃ）；注１，２，３：试剂１、２、３由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。— — —引物：以鼠疫菌Ｆ１基因保守序列设计（ＧｅｎＢａｎｋ号：Ｘ６１９９６．１的）引物组，组成如下：ＦＰ：ＡＡＧＴＡＣＡＴＧＧＧＡＴＣＡＣＣＣＧＣＧＣＧＧＣＴＡＴＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＣＢＰ：ＡＡＧＴＡＣＡＴＧＧＧＡＴＣＡＣＣＣＧＣＧＣＣＡＣＡＡＴＣＴＣＴＡＧＡＡＴＣＣＴＴＧＣＣＡＡＴＣＩＦ：ＧＣＡＴＣＴＧＴＡＡＡＧＴＴＡＡＣＡＧＡＴＧＴＧＣ — — —ｄＮＴＰ：四种核苷酸，每种浓度均为１０ｍＭ； — — —犅狊狋酶：８Ｕ／μＬ；２犛犖／犜５１０９—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.— — —反应缓冲液（ＲＭ）：Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ２０．０ｍＭ，硫酸铵１０．０ｍＭ，氯化钾１０．０ｍＭ，硫酸镁８．０ｍＭ，Ｔｗｅｅｎ  ２００．１％，甜菜碱０．８Ｍ，ｄＮＴＰ（每种各）１．４ｍＭ，引物ＦＰ、ＢＰ各１．６μＭ，ＩＦ０．８μＭ，ｐＨ８．８； — — —显色液：甲酚红２．０ｍＭ，苯酚红０．５ｍＭ。或荧光染料：ＥｖｅＧｒｅｅｎ（２０×水溶液）。二者选一； — — —阳性对照：可溯源的已鉴定菌株，或含目的片段的ＤＮＡ。８　检测程序８．１　样本前处理８．１．１　白色粉末、物体表面等环境样本以无菌生理盐水或多功能样品处理液浸湿无菌采样棉签，沾取白色粉末，或擦拭受污物体表面，置于含２ｍＬ多功能样品处理液的试管内，油性笔编号标记待检。８．１．２　啮齿动物脏器样本以无菌操作采取的肝、脾、肺、心血及有可疑病理改变的淋巴结等组织，加入４滴～８滴（约１００μＬ～２００μＬ）研磨液（生理盐水或多功能样品处理液）研磨。用采样棉签沾取研磨匀浆液（约５０μＬ～１００μＬ），置于含２ｍＬ多功能样品处理液的试管内，油性笔编号标记待检。８．１．３　蚤样本蚤经种类鉴定后，以采集时间、地点、种类分组，１０只～２０只为一组待检样本。待检样本加入４滴～８滴（约１００μＬ～２００μＬ）研磨液（生理盐水或多功能样品处理液）研磨。用采样棉签沾取研磨匀浆液（约５０μＬ～１００μＬ），置于含２ｍＬ多功能样品处理液的试管内，油性笔编号标记待检。８．１．４　人体样本可包括人静脉血、淋巴液、带血痰液、带血粪便、咽部分泌物、眼分泌物、水泡／脓泡液、脑脊液、溃疡面和痂皮下的创面等。无菌采集的待检者的静脉血３ｍＬ～５ｍＬ，室温静置数ｍｉｎ使血液凝固，上层为血清。用采样棉签沾取血清、淋巴液、带血痰液、分泌物或固体排泄物，置于含２ｍＬ多功能样品处理液的试管内，油性笔编号标记待检。８．２　鼠疫耶尔森菌的犘犛犚检测８．２．１　样本处理与模板制备将采样棉签置于含２ｍＬ多功能样品处理液的试管内，摇动混匀后，置于恒温扩增检测仪（或金属浴、水浴锅），９５℃加热１０ｍｉｎ。取出 /G21至室温后即可作为样本ＤＮＡ模板。８．２．２　犘犛犚反应体系及加样鼠疫耶尔森菌ＰＳＲ反应的结果判定可选用显色法，也可选择荧光染料法，其反应体系及加样量分别见表１和表２。设阳性、阴性对照检测。３犛犖／犜５１０９—２０１９ rH