SN-T 5107-2019 出入境口岸蚊媒传染病多种病原体基因悬浮芯片检测方法

书书书犐犆犛１１．０２０犆６２中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜５１０７—２０１９出入境口岸蚊媒传染病多种病原体基因悬浮芯片检测方法犃犿狌犾狋犻狆犾犲狓犾犻狇狌犻犱犫犲犪犱犪狉狉犪狔犳狅狉犱犲狋犲犮狋犻狀犵犿狅狊狇狌犻狋狅  犫狅狉狀犲犱犻狊犲犪狊犲狊狅犳犿狌犾狋犻狆犾犲狓狆犪狋犺狅犵犲狀狊犪狋犲狀狋狉狔 犲狓犻狋狆狅狉狋狊２０１９０９０３发布２０２００３０１实施中华人民共和国海关总署发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国石家庄海关。本标准主要起草人：李云、史玲莉、闫冀焕、沈军、李薇、兰景、付晓昀。 Ⅰ犛犖／犜５１０７—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.出入境口岸蚊媒传染病多种病原体基因悬浮芯片检测方法１　范围本标准规定了用于出入境口岸快速筛查黄热病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、登革病毒（Ⅰ～Ⅳ型）、疟原虫（间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫）６种口岸重点关注的蚊媒病原体的基因悬浮芯片筛查方法。本标准适用于国境口岸入出境人员或蚊类携带以上六种病原体的筛查。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求ＳＮ／Ｔ２７８８　医学媒介生物样品保存与运送要求ＷＳ２３３　微生物和生物医学实验室生物安全通用准则３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１　蚊媒传染病　犕狅狊狇狌犻狋狅  犫狅狉狀犲犱犻狊犲犪狊犲狊是由病媒蚊子传播的自然疫源性疾病，常见的有日本脑炎、疟疾、登革热、丝虫病、黄热病等危害性较强的传染病。３．２　基因悬浮芯片　犵犲狀犲狊狌狊狆犲狀狊犻狅狀犪狉狉犪狔利用带编码的微球体作为载体，流式细胞仪作为检测平台，对核酸进行大规模测定的一种生物芯片技术。４　生物安全防护要求４．１　实验室应遵循ＧＢ１９４８９和ＷＳ２３３对生物安全 Ⅱ级（ＢＳＬ  ２）实验室的生物安全要求。４．２　使用过的实验用品应遵照ＧＢ１９４８９的要求，对废弃物应进行无害化处理。５　对象５．１　出入境口岸截获的来自蚊媒传染病流行国家或地区人员的可疑病例样本。５．２　出入境口岸截获来自蚊媒传染病流行国家或地区的蚊类样本。１犛犖／犜５１０７—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.６　样本的采集、保存和运送６．１　样本采集６．１．１　采集来自于疫区的人员、出入境可疑人员、申请检验人员的血液。６．１．２　采集来自疫区的藏匿于交通工具、运输设备中的蚊类或以其他方式藏匿的蚊类样本。６．２　样本的送检和处理６．２．１　蚊类样本：将采集的蚊类直接放入－２０℃冰箱冻死后，取出，分类编号，按３０只一份，装入２ｍｌ螺口塑料管内，于－７０℃运输或保存待检。６．２．２　血清和血浆：用无菌注射器直接吸取至无菌离心管中处理，编号备用。７　主要设备与试剂７．１　主要设备悬浮芯片系统、荧光显微镜、水平电泳仪、凝胶成像系统、离心机、ＰＣＲ仪、生物安全柜、移液器、核酸蛋白检测仪、真空泵、涡流振荡仪。７．２　主要试剂ＭＥＭ和Ｈａｎｋ’ｓ液、标本处理液（见附录Ａ中Ａ．１）、ＰＣＲ反应液（见附录Ａ中Ａ．２）、氯化四甲铵（ＴＭＡＣ）、１．５× ＴＭＡＣ杂交液（见附录Ａ中Ａ．３）、１×ＴＭＡＣ杂交液（见附录Ａ中Ａ．４）、羧基化编码微球（ＢｉｏＲａｄ公司）、２［Ｎ 吗啉］乙磺酸（ＭＥＳ）（ｐＨ４．５）、１ （３ 二甲氨基丙基） ３ 乙基碳二亚胺盐酸盐（ＥＤＣ）、ＳＤＳ、Ｎ 十二烷基肌氨酸钠、ＴＥ（ｐＨ８．０）（见附录Ａ中Ａ．５）、链亲和素 藻红蛋白（ＳＡ  ＰＥ）、乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）、７５％乙醇、Ｔｒｉｚｏｌ、三氯甲烷、吐温 ２０、随机引物、ＡＭＶ逆转录试剂盒、２０％螯合树脂Ｃｈｅｌｅｘ１００。８　检测方法８．１　犇犖犃提取８．１．１　从血样本中提取疟原虫ＤＮＡ的方法８．１．１．１　取２０μＬ全血放入１．５ｍＬ离心管内。８．１．１．２　加２００μＬ预热的５％Ｃｈｅｌｅｘ１００，１００℃加热１０ｍｉｎ，期间振荡３次～５次。８．１．１．３　１２０００ｇ离心３ｍｉｎ，取上清液至一干净的０．５ｍＬ离心管中，４℃或－２０℃保存备用。８．１．２　从蚊类样本中提取疟原虫犇犖犃的方法８．１．２．１　将待检蚊类样本在组织研磨器中研磨或电动匀浆机中匀浆２０ｓ～３０ｓ，使样品匀浆成糊状，１２０００ｇ离心３ｍｉｎ，取上清液作为样品。８．１．２．２　加入１５０μＬ重蒸水和５０μＬ的２０％Ｃｈｅｌｅｘ１００，９５℃加热１０ｍｉｎ，以提取ＤＮＡ。８．１．２．３　在加热过程中，每２ｍｉｎ涡旋一次。８．１．２．４　１２０００ｇ离心此混合物３ｍｉｎ，取上清液至一干净的０．５ｍＬ离心管中，４℃或－２０℃ 保存备用。２犛犖／犜５１０７—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.８．２　犚犖犃提取８．２．１　将待检蚊类样本从－７０℃容器中取出，在冰上操作，倒入研磨器中，加入Ｈａｎｋ’ｓ液１ｍＬ吹洗，弃去液体后加入１ｍＬ标本处理液，反复研磨至组织碎片基本消失，随后将研磨液吸入１．５ｍＬｅｐｐｅｎｄｏｒｆ离心管，配平后置预冷４℃的离心机上，２００００ｇ离心１０ｍｉｎ。取上清液进行核酸提取，剩余的蚊标本研磨液需保存在－７０℃冰箱以备复查。８．２．２　取灭菌的１．５ｍＬ离心管加入１ｍＬ裂解液Ｔｒｉｚｏｌ，然后分别加入８．２．１处理后的被检样本３００μＬ，再加入２００μＬ三氯甲烷，充分振荡均匀（如使用旋涡振荡器，避免振荡过于强烈产生乳化层）。在４℃条件下，１２０００ｇ离心１５ｍｉｎ。８．２．３　将上步离心后样品的上清液５００μＬ转移至新的１．５ｍＬ灭菌的离心管，加入４００μＬ预冷的异丙醇，避免吸到中间层，盖紧瓶盖，颠倒混均。－２０℃冰箱静置３０ｍｉｎ。８．２．４　１２０００ｇ离心１５ｍｉｎ，轻轻倒去上清液，每管加入５００μＬ７５％乙醇，颠倒洗涤。８．２．５　１２０００ｇ离心１０ｍｉｎ，轻轻倒去上清液，吸去残余液体，室温下干燥５ｍｉｎ。８．２．６　将抽提的ＲＮＡ溶解在２０μＬＤＥＰＣ水中待用。８．３　犘犆犚扩增８．３．１　逆转录合成犮犇犖犃以随机引物作为逆转录引物，选择商品化逆转录试剂盒，按试剂说明书操作，以病毒ＲＮＡ为模板合成ｃＤＮＡ。８．３．２　多重犘犆犚扩增８．３．２．１　多重ＰＣＲ扩增引物的选择：扩增引物设计方法见附录Ｂ表Ｂ．１，以随机引物合成的ｃＤＮＡ为模板。８．３．２．２　西尼罗病毒ＰＣＲ反应体系见表１。表１体系成分用量（μＬ）１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ２μＬｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏＬ／Ｌ）２μＬｇｏｌｄＴａｑ酶（５Ｕ／μＬ）０．０７μＬＷＮＶ  Ｆ（５μＭ）０．３μＬＷＮＶ  Ｒ（５μＭ）１．５μＬ样本反转录产物ｃＤＮＡ１μＬｄｄＨ２Ｏ１３．１３μＬ终体积２０μＬ　　ＰＣＲ反应程序：９４℃５ｍｉｎ；９４℃３０、５６℃３０ｓ、７２℃３０ｓ，进行４０个循环；７２℃１０ｍｉｎ；１０℃保温。８．３．２．３　黄热病毒、登革病毒 Ⅰ型、登革病毒 Ⅳ型多重ＰＣＲ反应体系见表２。３犛犖／犜５１０７—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.表２体系成分用量（μＬ）１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ２μＬｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏＬ／Ｌ）２μＬｇｏｌｄＴａｑ酶（５Ｕ／μＬ）０．０７μＬＹＦＶ  Ｆ（５μＭ）０．３μＬＹＦＶ  Ｒ（５μＭ）１．５μＬＤＥＮＶⅠ Ｆ（５μＭ）０．３μＬ