SN-T 5106-2019 登革热媒介蚊类DNA条形码鉴定方法

书书书犐犆犛１１．０２０犆６２中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜５１０６—２０１９登革热媒介蚊类犇犖犃条形码鉴定方法犇犖犃犫犪狉犮狅犱犻狀犵犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犇犲狀犵狌犲狏犲犮狋狅狉  犿狅狊狇狌犻狋狅犲狊２０１９０９０３发布２０２００３０１实施中华人民共和国海关总署发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福州海关。本标准起草人：方义亮、张建庆、林醒忠、王宇平、黄恩炯、房长天、吴荣泉。 Ⅰ犛犖／犜５１０６—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.登革热媒介蚊类犇犖犃条形码鉴定方法１　范围本标准规定了登革热媒介蚊类ＤＮＡ条形码鉴定方法中ＤＮＡ提取、基因的扩增及序列的比对分析、结果判定等。本标准适用于登革热媒介蚊类白纹伊蚊（犃犲犱犲狊犪犾犫狅狆犻犮狋狌狊）、埃及伊蚊（犃犲犱犲狊犪犲犵狔狆狋犻）成虫、幼虫、蛹、残肢不全等标本的ＤＮＡ条形码鉴定。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求ＳＮ／Ｔ１８７６　医学媒介生物标本采集、制作及保存规程ＳＮ／Ｔ２７５２．４　卫生检疫人员的自我防护规范　第４部分：实验室人员ＳＮ／Ｔ４２７８　国境口岸医学媒介昆虫ＤＮＡ条形码鉴定操作规程ＷＳ／Ｔ２３０　临床诊断中聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术的应用３　方法原理利用通用引物对线粒体ＤＮＡ中的犆犗犐基因的特定片段进行扩增，ＰＣＲ产物克隆或者直接测序后，得到长度不少于５００ｂｐ的有效序列，与本标准的标准序列进行比对，从而达到物种快速准确鉴定的目的。４　鉴定程序４．１　准备实验室需具备的设备和试剂参见附录Ａ。实验室生物安全符合ＧＢ１９４８９和ＳＮ／Ｔ２７５２．４的规定；ＰＣＲ防污染措施遵照ＷＳ／Ｔ２３０的要求。配置电泳液ＴＡＥ（１×ＴＡＥ）：将Ｔｒｉｓ碱２４２ｇ，冰醋酸５７．１ｍＬ，０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１００ｍＬ，定容至１Ｌ，用双蒸水稀释５０倍。４．２　标本处理４．２．１　取样标本样品经过冷冻或乙醚麻醉，死后取成批同种样品的单份标本、珍稀单份标本取对称一侧组织（如单侧蚊足）置于灭菌的洁净１．５ｍＬ离心管留用，如长期不用需放置体积分数为９０％以上乙醇－２０℃保存。标本的其它同种个体或者部分针插作为凭证标本。１犛犖／犜５１０６—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.４．２．２　凭证标本制作将取样后的标本制作成凭证标本，标本的制作按照ＳＮ／Ｔ１８７６的要求执行。４．３　犇犖犃制备将单份样品（成虫、幼虫、蛹）置于已灭菌的洁净１．５ｍＬ离心管后用研磨棒研磨，利用商品化昆虫ＤＮＡ提取试剂盒进行蚊虫基因组提取（样品为单只蚊的，需去掉头部后（如有吸血的需要去腹部）后再研磨）；样品为少量对称一侧组织（单侧蚊足）置于已灭菌的洁净１．５ｍＬ离心管后用研磨棒研磨，利用微量组织ＤＡＮ提取方法（参见附录Ｂ）进行蚊虫基因组的制备，制备好的ＤＮＡ进行浓度及纯度测定后，保存至－２０℃冰箱备用。４．４　犘犆犚扩增４．４．１　引物ＬＣＯ１４９０：５’ ＧＧＴＣＡＡＣＡＡＡＴＣＡＴＡＡＡＧＡＴＡＴＴＧＧ  ３ ’ ＨＣＯ２１９８：５’ ＴＡＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＡＡＡＡＡＴＣＡ  ３ ’ ４．４．２　扩增体系推荐用５０μＬ体系，可用商品化的ＰＣＲｍｉｘ。验证ＰＣＲ体系有无污染，可同时设置空白对照和阴性对照；验证ＰＣＲ反应正常，可设置阳性对照。ＴａｑＰＣＲＭａｓｔｅｒｍｉｘ　　　　　　　２５μＬ正反引物（１０μＭ）各４μＬ模板（５０～１００μｇ／μＬ）３μＬｄｄＨ２Ｏ１４μＬ为了提高反应的效果，根据模板的浓度，可以适当增加模板的体积，同时相应减少ｄｄＨ２Ｏ体积，体系体积不变。４．４．３　扩增条件第一步：９４℃５ｍｉｎ；第二步：９５℃３０ｓ，４６℃３０ｓ，７２℃４０ｓ，３５个循环；第三步：７２℃７ｍｉｎ。４．５　犘犆犚产物检测４．５．１　琼脂糖凝胶的配置称取１．５ｇ的琼脂粉倒进盛有１００ｍＬ１×ＴＡＥ的烧瓶内，置入微波炉加热使其充分溶解直至透亮即可。４．５．２　电泳取５μＬＰＣＲ扩增产物（内含有染料），点样于质量浓度为１．５％的琼脂糖凝胶（含有溴化乙锭），电泳缓冲液为１×ＴＡＥ，在恒压８０Ｖ电泳３０ｍｉｎ，用凝胶成像系统成像并拍摄。４．６　序列测定ＣＯＩ序列扩增产物电泳条带在７５０ｂｐ左右（参见附录Ｃ），具有目的片段电泳条带的扩增产物可委２犛犖／犜５１０６—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.托专业的测序公司进行双向测定（测序引物同扩增引物），送样具体按照所选公司的要求进行。有条件的实验室可以选择克隆测序，克隆的流程按ＳＮ／Ｔ４２７８规定执行。４．７　序列分析测序结果利用生物信息学软件进行剪接编辑，比对峰图和正反向测序结果是否有误，去掉两端引物部分序列。与附录Ｄ中白纹伊蚊标准序列、附录Ｅ的埃及伊蚊标准序列进行比对，比对流程参见附录Ｆ。５　结果判定比对结果相似种为白纹伊蚊并且相似度大于或等于９８％者为白纹伊蚊（参见附录Ｆ）；比对结果相似种为埃及伊蚊并且相似度大于或等于９８％者为埃及伊蚊（参见附录Ｆ）。３犛犖／犜５１０６—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.附　录　犃（资料性附录）主要设备与试剂犃．１　仪器和用具普通台式离心机（相对离心力大于１４０００犵）、各量程（２μＬ、１０μＬ、２０μＬ、１００μＬ、２００μＬ、１０００μＬ）可调移液器、温度可调式水浴锅、生物安全柜或者超净工作台、ＰＣＲ扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、冰箱。犃．２　耗材１．５ｍＬ离心管、０．２ｍＬＰＣＲ管、各量程的移液器ＴＩＰＳ、无粉一次性手套。犃．３　试剂和材料ＰＣＲ需要的试剂：体积分数为７５％乙醇、动物组织基因组ＤＮＡ提取试剂盒、ＴａｑＰＣＲＭａｓｔｅｒｍｉｘ（含染料）、ＰＣＲ产物纯化试剂盒、琼脂糖、ＤＮＡ标准分子量标、ＴＡＥ电泳液。使用微量组织提取ＤＮＡ需要：Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、ＮｏｎｉｄｅｔＰ  ４０、１００μｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ。克隆测序需要的试剂：ｐＧＭ  ＴＶｅｃｔｏｒ、ＴＯＰ１０感受态细胞、ｐＧＭ  ＴＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ、ＰＣＲＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔｆｏｒＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐＧＭ  ＴＣｌｏｎｅ、ＩＰＴＧ、Ｘ ｇａｌ。４犛犖／犜５１０６—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.附　录　犅（资料性附录）微量组织犇犃犖提取方法犅．１　配置裂解液配置１００ｍＬ裂解液（１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ  ＨＣｌｐＨ８．０，１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ  ４０，１００μｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ）犅．２　热裂解吸取３５μＬ裂解液，加样匀浆，加３５μＬｄｄＨ２Ｏ，煮沸５ｍｉｎ。犅．３　离心１００００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清备用。５犛犖／犜５１０６—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.附　录　犆（资料性附录）扩增产物电泳胶图注：Ｍ：ＤＮＡ标准分子量标；１：阴性对照；２：蛹样品；３：幼虫样品；４：成虫样品。图犆．１　扩增产物电泳胶图６犛犖／犜５１０６—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.