书书书犐 犆 犛１ １．０ ２ ０犆６ ２ 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜５ １ ０ ５—２ ０ １ ９ 国境口岸轮状病毒 （犅组）实时荧光犚 犜  犘 犆 犚 检测方法 犇 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀犿 犲 狋 犺 狅 犱狅 犳犚 狅 狋 犪 狏 犻 狉 狌 狊 （犵狉 狅 狌狆犅）犫狔狉 犲 犪 犾  狋 犻 犿 犲犳 犾 狌 狅 狉 犲 狊 犮 犲 狀 犮 犲犚 犜  犘 犆 犚犪 狋 犳 狉 狅 狀 狋 犻 犲 狉 狆狅 狉 狋 狊 ２ ０ １ ９０ ９０ ３发布 ２ ０ ２ ００ ３０ １实施 中华人民共和国海关总署 发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　本标准按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口 。本标准起草单位 ：中华人民共和国拱北海关 、中华人民共和国厦门海关 、中华人民共和国深圳海关 、深圳市计量质量检测研究院 。本标准主要起草人 ：莫秋华、杨坤宇、杨泽、汪海波、史蕾、陈晶、陈新彬、吴锦顺、涂承宁、史咏梅、杨国武。 Ⅰ犛 犖／犜５ １ ０ ５—２ ０ １ ９ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.国境口岸轮状病毒 （犅组）实时荧光犚 犜  犘 犆 犚 检测方法 １　范围 本标准规定了国境口岸成人腹泻轮状病毒 （Ｂ组）实时荧光 ＲＴ  Ｐ Ｃ Ｒ 检测的对象 、检测方法及结果报告。本标准适用于国境口岸成人腹泻轮状病毒 （Ｂ组）的实验室检测 。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｇ Ｂ１ ９ ４ ８ ９ 　实验室　生物安全通用要求 Ｓ Ｎ／Ｔ１ ７ ２ ０　出入境口岸轮状病毒感染监测规程 ＷＳ／Ｔ２ ３ ０　临床诊断中聚合酶链反应 （Ｐ Ｃ Ｒ）技术的应用人间传染的病原微生物名录 （原中华人民共和国卫生部 ） ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 ３．１轮状病毒 　狉 狅 狋 犪 狏 犻 狉 狌 狊属于呼肠孤病毒科 （犚 犲 狅 狏 犻 狉 犻 犱 犪 犲 ）轮状病毒属 （犚 狅 狋 犪 狏 犻 狉 狌 狊 ） ，为双链ＲＮＡ病毒，基因组分 １ １个节段，是引起人类 、哺乳动物类和鸟类腹泻的主要病原体 。轮状病毒有 ７个血清组 （Ａ～Ｇ） ，其中Ａ、Ｂ、Ｃ组能引起人和动物腹泻 。Ａ组轮状病毒最常见 ，它是婴幼儿腹泻首要的致病原 。Ｂ组轮状病毒感染对象没有年龄限制 ，主要感染 １ ５—４ ５岁的青壮年 ，但也可感染老人和婴幼儿 ，故又定名为成人腹泻轮状病毒 （ａ ｄ ｕ ｌ ｔｄ ｉ ａ ｒ ｒ ｈ ｅ ａｒ ｏ ｔ ａ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ，ＡＤＲＶ） 。 ３．２ 逆转录聚合酶链反应 　狉 犲 狏 犲 狉 狊 犲狋 狉 犪 狀 狊 犮 狉 犻 狆狋 犻 狅 狀狆狅 犾狔犿 犲 狉 犪 狊 犲犮 犺 犪 犻 狀狉 犲 犪 犮 狋 犻 狅 狀 ；犚 犜  犘 犆 犚将ＲＮＡ的逆转录 （ＲＴ）和ｃ ＤＮＡ的聚合酶链式扩增 （Ｐ Ｃ Ｒ）相结合的技术 。本标准采用一步法逆 转录聚合酶链式反应 （ＲＴ  Ｐ Ｃ Ｒ ） 。在一步法 ＲＴ  Ｐ Ｃ Ｒ 中，首先以ＲＮＡ为模板，利用下游特异性引物 ， 在依赖ＲＮＡ的ＤＮＡ聚合酶（逆转录酶 ）的作用下转录合成互补 ＤＮＡ（ｃ ＤＮＡ） ，该步称作 “逆转录” ：随 后，再以ｃ ＤＮＡ为模板，利用上游和下游特异性引物 ，在ＤＮＡ聚合酶的作用下进行 Ｐ Ｃ Ｒ循环扩增 ；最 终使ＲＮＡ分子的某个特定区域 （目的片段 ）被扩增达几百万倍 。 ３．３ 实时荧光 犚 犜  犘 犆 犚 　狉 犲 犪 犾  狋 犻 犿 犲犳 犾 狌 狅 狉 犲 狊 犮 犲 狀 犮 犲犚 犜  犘 犆 犚通过荧光染料或荧光标记的特异性荧光探针 ，对反转录后 Ｐ Ｃ Ｒ扩增的产物进行标记跟踪 ，利用荧 光信号累积实现实时在线监测整个 Ｐ Ｃ Ｒ反应过程 ，结合相应的软件可以对结果进行定性和定量分析 。 １犛 犖／犜５ １ ０ ５—２ ０ １ ９ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.本标准所采用的荧光探针是分子信标 （ｍ ｏ ｌ ｅ ｃ ｕ ｌ ａ ｒｂ ｅ ａ ｃ ｏ ｎ ）探针。分子信标探针是一种荧光标记的寡核 苷酸链，一般含有 ２ ５～３ ５个核苷酸 。在结构上 ，分子信标探针可以分为三部分 ，即环状区 、茎干区、荧光 基团和淬灭基团 。环状区：一般由１ ５～３ ０个核苷酸组成 ，可以与靶分子特异结合 ；茎干区：寡核苷酸链 两端的核酸序列互补配对形成的 ５～８个碱基对的 ＤＮＡ双链结构 ，在分子信标与靶分子结合过程中可 发生可逆性解离 ；荧光基团和淬灭基团 ：荧光报告基团 （如Ｆ ＡＭ）一般连接在 ５’端，荧光淬灭基团 （如 Ｄ ａ ｂ ｃｙｌ）一般连接在 ３’端。自由状态时的分子信标呈发夹结构 ，此时由于荧光基团与淬灭基团靠得很 近，荧光被淬灭 ；当与靶序列结合后 ，分子信标的空间构型发生改变 ，使荧光基团与淬灭基团距离变大 ， 分别位于伸展开的探针的两端 ，荧光得以恢复 。分子信标技术具有很高的特异性 ，而且操作简便 、灵敏 度高，特别是它可以进行实时定量检测 ，甚至可以用于活体分析 。 ３．４ 犆 狋值　犆狔犮 犾 犲狋 犺 狉 犲 狊 犺 狅 犾 犱在荧光Ｐ Ｃ Ｒ中，每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数 。 ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 Ｄ Ｅ Ｐ Ｃ：焦碳酸乙二酯 （ｄ ｉ ｅ ｔ ｈｙｌｐ ｙｒ ｏ ｃ ａ ｒ ｂ ｏ ｎ ａ ｔ ｅ ） Ｐ ＡＧ Ｅ：聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ｐｏ ｌｙａ ｃ ｒｙｌ ａ ｍ ｉ ｄ ｅｇｅ ｌｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｐｈ ｏ ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ） ＨＰ Ｌ Ｃ：高效液相色谱 （ｈ ｉｇｈｐｅ ｒ ｆ ｏ ｒ ｍ ａ ｎ ｃ ｅｌ ｉ ｑｕ ｉ ｄｃ ｈ ｒ ｏ ｍ ａ ｔ ｏ ｇｒ ａｐｈｙ） ｂｐ：碱基对（ｂ ａ ｓ ｅｐａ ｉ ｒ） Ｆ ＡＭ：６ 羧基一荧光素 （６  ｃ ａ ｒ ｂ ｏ ｘ ｙ ｆ ｌ ｕ ｏ ｒ ｅ ｓ ｃ ｅ ｉ ｎ ） ＤＡ Ｂ Ｃ ＹＬ ：４，４ 二甲氨基 偶氮苯 ４’羧酸（４，４  ｄ ｉ ｍ ｅ ｔ ｈ ｙｌ ａ ｍ ｉ ｎ ｏ  ａ ｚ ｏ ｂ ｅ ｎ ｚ ｅ ｎ ｅ  ４ ′  ｃ ａ ｒ ｂ ｏ ｘ ｙｌ ｉ ｃａ ｃ ｉ ｄ） ５　检测对象 ５．１　国境口岸发现的有呕吐 、腹泻和发热等症状 ，疑似腹泻病毒感染的急性肠胃炎病人 。 ５．２　其他申请检验的人员 。 ６　生物安全和 犘 犆 犚防污染要求 实验室生物安全应符合 Ｇ Ｂ１ ９ ４ ８ ９ 和《人间传染的病原微生物名录 》的规定。Ｐ Ｃ Ｒ防污染措施按 ＷＳ／Ｔ２ ３ ０的规定执行 。 ７　主要仪器 主要仪器设备如下 ： — — —二级Ｂ型生物安全柜 ； — — —台式高速冷冻离心机 （最高离心力 １ ２０ ０ ０× ｇ以上） ； — — —旋涡振荡器 ； — — —冰箱：４℃、－２ ０℃和－７ ０℃； — — —超净工作台 ； ２犛 犖／犜５ １ ０ ５—２ ０ １ ９ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.— — —微型离心机 ； — — —荧光定量 Ｐ Ｃ Ｒ仪； — — —电子天平 （ｄ＝１ｍｇ） ； — — —微波炉； — — —电泳仪； — — —高压灭菌锅 ； — — —超纯水器或双蒸水器 ； — — —微量可调移液器一套 （含以下５种规格：１ ０μＬ、２ ０μＬ、１ ０ ０μＬ、２ ０ ０μＬ、１ｍＬ） 。 ８　主要试剂 ８．１　无ＲＮＡ酶的Ｄ Ｅ Ｐ Ｃ水。 ８．２　引物和探针 ：ＲＴ  Ｐ Ｃ Ｒ 引物应为 Ｐ ＡＧ Ｅ以上级别纯化 ，探针为 ＨＰ Ｌ Ｃ纯化，引物和探针序列见９． ２． ３． １。 ８．３　一步法荧光 ＲＴ  Ｐ Ｃ Ｒ 基础试剂 ：宝生物工程 （大连）有限公司 Ｏ ｎ ｅＳ ｔ ｅｐＰ ｒ ｉ ｍ ｅ Ｓ ｃ ｒ ｉ ｐＴＭＲＴ  Ｐ Ｃ ＲＫ ｉ ｔ（Ｐ ｅ ｒ ｆ ｅ ｃ ｔＲ ｅ ａ ｌＴ ｉ ｍ ｅ ）１）。 １）　给出这一信息是为了方便本标准的使用者 ，并不表示对该产品的认可和推荐 。如果其他等效产品具有相同的 效果，则可使用这些等效产品 。９　检验程序 ９．１　样品采集 粪便标本和呕吐物标本的采集按照 Ｓ Ｎ／Ｔ１ ７ ２ ０执行。 ９．２　实验室检验 ９．２．１　样品处理 取黄豆大小约 １ ０ ０ｍｇ～２ ０ ０ｍｇ的粪便标本或呕吐物 ，或１ ０ ０μＬ～２ ０ ０μＬ水样便，加入８ ０ ０μＬ的生理盐水 ，剧烈振荡混匀 ，制成１ ０％～２ ０％的悬液：然后４℃，８０ ０ ０×ｇ离心５ｍ ｉ ｎ；转移上清至灭菌的干净离心管 。不能立即进行检测时 ，样本冻存于 －７ ０℃超低温冰箱备用 。 ９．２．２　病毒核酸提取 ９．２．２．１　犜 狉 犻 狕 狅 犾法 取处理好的样本 １ ５ ０μＬ，加入７ ５ ０μＬＴ ｒ ｉ ｚ ｏ ｌ 液，振荡混匀后室温静置 ５ｍ ｉ ｎ，然后加入 ２ ０ ０μＬ三氯甲烷，盖紧离心管 ，振荡混匀 １ ５ｓ后室温静置 ５ｍ ｉ ｎ，４℃，１ ２０ ０ ０× ｇ离心１ ０ｍ ｉ ｎ，取上层水相至另一离