SN-T 5100-2019 国境口岸卡萨诺尔森林病病毒实时荧光RT-PCR检测方法

书书书犐犆犛１１．０２０犆６２中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜５１００—２０１９国境口岸卡萨诺尔森林病病毒实时荧光犚犜  犘犆犚检测方法犇犲狋犲犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱犳狅狉犓狔犪狊犪狀狌狉犉狅狉犲狊狋犱犻狊犲犪狊犲狏犻狉狌狊犫狔狉犲犪犾  狋犻犿犲犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀犮犲犚犜  犘犆犚犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋狊２０１９０９０３发布２０２００３０１实施中华人民共和国海关总署发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准根据ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、杭州富集生物科技有限公司、新疆国际旅行卫生保健中心。本标准主要起草人：马雪征、张丽萍、杨烨、胡孔新、孙肖红。 Ⅰ犛犖／犜５１００—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.国境口岸卡萨诺尔森林病病毒实时荧光犚犜  犘犆犚检测方法１　范围本标准规定了国境口岸卡萨诺尔森林病病毒检测的生物安全要求、标本的采集、运输和保存、标本的处理，卡萨诺尔森林病病毒实时荧光ＲＴ  ＰＣＲ检测方法。本标准适用于国境口岸入出境人员携带卡萨诺尔森林病病毒的核酸检测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９　实验室生物安全通用要求ＷＳ／Ｔ２３０　临床诊断中聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术的应用病原微生物实验室生物安全通用准则可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定　（原中华人民共和国卫生部令第４５号）人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构管理办法（原中华人民共和国卫生部）人间传染的病原微生物名录（原中华人民共和国卫生部）３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件３．１卡萨诺尔森林病病毒　（犓狔犪狊犪狀狌狉犉狅狉犲狊狋犱犻狊犲犪狊犲狏犻狉狌狊，犓犉犇犞）该病毒属于黄病毒科的哺乳动物蜱传病毒组，于１９５７年被发现，源自印度纳塔克邦卡萨诺尔森林病死的猴子身上。自那时起，每年有４００～５００人类病例被报道。该病的症状包括高热与额叶头痛，伴有出血症状，如鼻腔出血、咽喉出血和牙龈出血，以及胃肠出血等。蜱为主要传播媒介，可引起发热、出血、肌痛和脑炎，死亡率为３％～５％，主要分布在印度西部地区，我国研究人员从１９８９年采集的一名发热患者血清标本中分离到Ｎａｎｊｉａｎｙｉｎｖｉｒｕｓ后经分子生物学等方法鉴定为ＫＦＤＶ的变异株，提示在我国云南横断山脉地区曾有ＫＦＤ的发生。３．２实时荧光　犚犜  犘犆犚狉犲犪犾  狋犻犿犲犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀犮犲犚犜  犘犆犚实时荧光ＲＴ  ＰＣＲ方法是在常规ＲＴ  ＰＣＲ的基础上，加入一条特异性的实时荧光探针。该探针为一段寡核苷酸，两端分别标记一个报告基团和一个淬灭实时荧光基团。探针完整时，报告基团发射的实时荧光信号被淬灭基团吸收；ＰＣＲ扩增时，利用Ｔａｑ酶的５’ ３’外切酶活性将探针酶切降解，使报告实时荧光基团和淬灭基团分离，从而实时荧光监测系统可以接受到实时荧光信号。每个反应管内的实时荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，用Ｃｔ值表示。１犛犖／犜５１００—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.３．３犆狋值Ｃｔ值是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。４　缩略语下列缩略语适用于本文件。ＤＥＰＣ：焦碳酸乙二酯（ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）ＦＡＭ：６ 羧基一荧光素（６  ｃａｒｂｏｘｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）ＢＨＱ１：黑洞淬灭基团（ｂｌａｃｋｈｏｌｅｑｕｅｎｃｈｅｒ１）５　检测对象出入境口岸发现的可疑病例。６　实验室生物安全和犘犆犚防污染要求按照ＧＢ１９４８９、《人间传染的病原微生物名录》和《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》的要求，相关材料的生物安全要求如下： — — —卡萨诺尔森林病病毒危害程度分类为第一类； — — —实验室应遵循ＧＢ１９４８９和ＷＳ２３３，未经培养的感染性材料的操作应在生物安全 Ⅲ级（ＢＳＬ  ３或ＡＢＳＬ  ３）实验室内进行，灭活材料在生物安全 Ⅱ级（ＢＳＬ  ２）实验室内进行； — — —卡萨诺尔森林病病毒感染性材料运输包装分类为Ａ类，ＵＮ编号为ＵＮ２８１４； — — —使用过的实验用品应遵照ＧＢ１９４８９对废弃物的处理要求进行无害化处理： — — —疑似卡萨诺尔森林病病毒材料的包装及转运应符合原中华人民共和国卫生部第４５号令； — — —ＰＣＲ防污染措施按照ＷＳ／Ｔ２３０的规定执行。７　仪器本方法使用的主要仪器如下：— — —实时荧光ＰＣＲ仪； — — —超净工作台； — — —二级生物安全柜； — — —高压灭菌锅； — — —低温高速离心机：最大离心力２００００ｓ： — — —漩涡振荡器； — — —冰箱：４℃、－２０℃和－７０℃； — — —移液器：１０μＬ、２０μＬ、１００μＬ、２００μＬ和１ｍＬ； — — —恒温水浴锅； — — —无菌注射器。８　试剂本方法使用的主要试剂如下：２犛犖／犜５１００—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.— — —核酸提取试剂：用德国Ｑｉａｇｅｎ公司ＱＩＡａｍｐＶｉｒａｌＲＮＡＫｉｔ提取病毒核酸１）； — — —实时荧光ＲＴ  ＰＣＲ试剂：Ａｇ Ｐａｔｈ  ＩＤＴＭＯｎｅｓｔｅｐＲＴ  ＰＣＲＫｉｔ２）； — — —无ＲＮＡ酶的ＤＥＰＣ水： — — —引物和探针序列见表１。表１　卡萨诺尔森林病病毒实时荧光犚犜  犘犆犚检测的引物和探针引物／探针名称序列（５’ ３’ ）ＫＦＤＶ  ＦＴＧＧＡＡＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＡＡＧＡＧＫＦＤＶ  ＲＴＣＡＴＣＣＣＣＡＣＴＧＡＣＣＡＧＣＡＴＫＦＤＶ  ＰＦＡＭ  ＡＴＧＧＡＧＡＧＧＡＧＣＧＣＣＴＧＡＣＣＣＧ  ＢＨＱ１９　检测程序９．１　标本的采集无菌采集发病后５天内静脉血３～５ｍＬ，５００ｇ离心１０ｍｉｎ，收集血清于２ｍＬ无菌螺口塑料管中，用耐低温油性记号笔对采集的样本进行编号登记。９．２　标本的保存采集的标本应保存在４℃条件下，样本保存的生物安全要求应按照《人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构管理办法》。９．３　标本的转运疑似卡萨诺尔森林病病毒感染材料的包装及转运应符合《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》。９．４　核酸提取９．４．１　核酸的提取按照商品化核酸提取试剂盒进行。将采集的样本平衡至室温静置１０ｍｉｎ，取１４０μＬ上清液进行试验。９．４．２　用移液器吸取３１０μＬＡＶＬ加入到３１０μｇ的ＣａｒｒｉｅｒＲＮＡ中，使ＣａｒｒｉｅｒＲＮＡ彻底溶解，得到终浓度为１μｇ／μＬ的ＣａｒｒｉｅｒＲＮＡ水溶液。９．４．３　根据样本的数量（ｎ），先吸取裂解液（ｎ×０．５６）ｍＬ，再吸取ＣａｒｒｉｅｒＲＮＡ水溶液（ｎ×５．６）μＬ将两者进行充分混匀，每管分装０．５６ｍＬ。（注：剩余ＣａｒｒｉｅｒＲＮＡ水溶液应及时分装到无核酸酶的离心管中，－２０℃保存，避免反复冻融）。９．４．４　向每管ＣａｒｒｉｅｒＲＮＡ  裂解缓冲液中加入１４０μＬ的样本，混匀后旋振荡１５ｓ。１）和２）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。９．４．５　在室温下静置１０ｍｉｎ后，短暂离心。９．４．６　加入５６０μＬ的无水乙醇，并涡旋振荡１５ｓ。９．４．７　短暂离心后，吸取离心管中的６３０μＬ混合液（包括ＣａｇｉｅｒＲＮＡ裂解缓冲液、采集液及无水乙醇），转移到带有离心管的吸附柱内，以６０００ｇ离心１ｍｉｎ。３犛