SN-T 5099-2019 国境口岸亨德拉病毒实时荧光RT-PCR检测方法

书书书犐犆犛１１．０２０犆６２中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜５０９９—２０１９国境口岸亨德拉病毒实时荧光犚犜  犘犆犚检测方法犇犲狋犲犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱犳狅狉犎犲狀犱狉犪犞犻狉狌狊犫狔狉犲犪犾  狋犻犿犲犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀犮犲犚犜  犘犆犚犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋狊２０１９０９０３发布２０２００３０１实施中华人民共和国海关总署发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准根据ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、新疆国际旅行卫生保健中心、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国广州海关。本标准主要起草人：马雪征、杨烨、林燕如、张丽萍、胡孔新、史蕾、孙肖红。 Ⅰ犛犖／犜５０９９—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.国境口岸亨德拉病毒实时荧光犚犜  犘犆犚检测方法１　范围本标准规定了国境口岸亨德拉病毒检测的生物安全要求、标本的采集、运输和保存、标本的处理，亨德拉病毒实时荧光ＲＴ  ＰＣＲ检测方法。本标准适用于国境口岸入出境人员携带亨德拉病毒的核酸检测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９　实验室生物安全通用要求ＷＳ／Ｔ２３０　临床诊断中聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术的应用ＷＳ２３３　病原微生物实验室生物安全通用准则可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（原中华人民共和国卫生部令第４５号）人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构管理办法（原中华人民共和国卫生部）人间传染的病原微生物名录（原中华人民共和国卫生部）３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件３．１亨德拉病毒（犎犲狀犱狉犪狏犻狉狌狊，犎犲狏）亨德拉病毒属于亨德拉尼帕属（犎犲狀犻狆犪狏犻狉狌狊），是副粘病毒科（犘犪狉犪犿狔狓狅狏犻狉犻犱犪犲）的一个新病毒类别。亨德拉病毒是一种人畜共患病病毒，于１９９４年在澳大利亚昆士兰州布里斯班郊区的亨德拉首次被发现，能引起严重的呼吸道疾病。到目前为止ＨｅＶ感染的人类病例均是与感染马匹有密切接触的人，因此密切接触是ＨｅＶ的传播途径之一。ＨｅＶ病毒造成的疾病的典型特征是严重的呼吸困难和高死亡率，还表现为人接触性感染。人感染后发病初期有显著的呼吸道症状，伴有发热和肌痛；有的出现神经症状，常表现中度脑炎。３．２实时荧光犚犜  犘犆犚　狉犲犪犐  狋犻犿犲犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀犮犲犚犜  犘犆犚实时荧光ＲＴ  ＰＣＲ方法是在常规ＲＴ  ＰＣＲ的基础上，加入一条特异性的实时荧光探针。该探针为一段寡核苷酸，两端分别标记一个报告基团和一个淬灭实时荧光基团。探针完整时，报告基团发射的实时荧光信号被淬灭基团吸收：ＰＣＲ扩增时，利用Ｔａｑ酶的５’ ３’外切酶活性将探针酶切降解，使报告实时荧光基团和淬灭基团分离，从而实时荧光监测系统可以接受到实时荧光信号。每个反应管内的实时荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，用Ｃｔ值表示。１犛犖／犜５０９９—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.３．３犆狋值Ｃｔ值是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。４　缩略语下列缩略语适用于本文件。ＤＥＰＣ：焦碳酸乙二酯（ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）ＦＡＭ：６ 羧基荧光素（６  ｃａｒｂｏｘｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）ＢＨＱｌ：黑洞淬灭基团（ｂｌａｃｋｈｏｌｅｑｕｅｎｃｈｅｒｌ）５　检测对象出入境口岸发现的可疑病例。６　实验室生物安全和犘犆犚防污染要求按照ＧＢ１９４８９、《人间传染的病原微生物名录》和《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》的要求，相关材料的生物安全要求如下： — — —亨德拉病毒危害程度分类为第一类； — — —个人防护遵循ＧＢ１９４８９； — — —实验室应遵循ＧＢ１９４８９和ＷＳ２３３，未经培养的感染性材料的操作应在生物安全 Ⅲ级（ＢＳＬ  ３或ＡＢＳＬ  ３）实验室内进行，灭活材料在生物安全 Ⅱ级（ＢＳＬ  ２）实验室内进行； — — —亨德拉病毒感染性材料运输包装分类为Ａ类，ＵＮ编号为ＵＮ２８１４； — — —使用过的实验用品应遵照ＧＢ１９４８９对废弃物的处理要求进行无害化处理； — — —疑似亨德拉病毒材料的包装及转运应符合原中华人民共和国卫生部第４５号令； — — —ＰＣＲ防污染措施按照ＷＳ／Ｔ２３０的规定执行。７　仪器本标准使用的主要仪器如下： — — —实时荧光ＰＣＲ仪； — — —超净工作台； — — —二级生物安全柜； — — —高压灭菌锅； — — —低温高速离心机：最大离心力２００００ｇ； — — —漩涡振荡器； — — —冰箱：４℃、－２０℃和－７０℃； — — —移液器：１０μＬ、２０μＬ、１００μＬ、２００μＬ和１ｍＬ； — — —恒温水浴锅； — — —无菌注射器。２犛犖／犜５０９９—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.８　试剂本方法使用的主要试剂如下： — — —核酸提取试剂：用德国Ｏｉａｇｅｎ公司ＱＩＡａｍｐＶｉｒａｌＲＮＡＫｉｔ提取病毒核酸１）； — — —实时荧光ＲＴ  ＰＣＲ试剂：Ａｇ Ｐａｔｈ  ＩＤＴＭＯｎｅｓｔｅｐＲＴ  ＰＣＲＫｉｔ，美国Ａｍｂｉｏｎ公司产品２）；１）和２）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。— — —无ＲＮＡ酶的ＤＥＰＣ水； — — —引物和探针序列见表１。表１　亨德拉病毒实时荧光犚犜  犘犆犚检测的引物和探针引物／探针名称序列（５’ ３’ ）ＨｅＶ  ＦＣＴＴＣＧＡＣＡＡＡＧＡＣＧＧＡＡＣＣＡＡＨｅＶ  ＲＣＣＡＧＣＴＣＧＴＣＧＧＡＣＡＡＡＡＴＴＨｅＶ  ＰＦＡＭ  ＴＧＧＣＡＴＣＴＴＴＣＡＴＧＣＴＣＣＡＴＣＴＣＧＧ  ＴＡＭＲＡ９　检测程序９．１　标本的采集无菌采集发病后５天内静脉血３～５ｍＬ，５００ｇ离心１０ｍｉｎ，收集血清于２ｍＬ无菌螺口塑料管中，用耐低温油性记号笔对采集的样本进行编号登记。９．２　标本的保存采集的标本应保存在４℃条件下，样本保存的生物安全要求应按照《人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构管理办法》。９．３　标本的转运疑似亨德拉病毒感染材料的包装及转运应符合《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》。９．４　核酸提取９．４．１　核酸的提取按照商品化核酸提取试剂盒进行。将采集的样本平衡至室温静置１０ｍｉｎ，取１４０μＬ上清液进行试验。９．４．２　用移液器吸取３１０μＬＡＶＬ加入到３１０μｇ的ＣａｒｒｉｅｒＲＮＡ中，使ＣａｒｒｉｅｒＲＮＡ彻底溶解，得到终浓度为１μｇ／μＬ的ＣａｒｒｉｅｒＲＮＡ水溶液。９．４．３　根据样本的数量（ｎ），先吸取裂解液（ｎ×０．５６）ｍＬ，再吸取ＣａｒｒｉｅｒＲＮＡ水溶液（ｎ×５．６）μＬ将两者进行充分混匀，每管分装０．５６ｍＬ。（注：剩余ＣａｒｒｉｅｒＲＮＡ水溶液应及时分装到无核酸酶的离心管中，－２０℃保存，避免反复冻融）。９．４．４　向每管ＣａｒｒｉｅｒＲＮＡ  裂解缓冲液中加入１４０μＬ的样本，混匀后旋振荡１５ｓ。９．４．５　在室温下静置１０ｍｉｎ后，短暂离心。３犛犖／犜５０９９—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.９．４．６　加入５６０μＬ的无水乙醇，并涡旋振荡１５ｓ。９．４．７　短暂离心后，吸取离心管中的６３０μＬ混合液（包括ＣａｒｒｉｅｒＲＮＡ裂解缓冲液、采集液及无水乙醇），转