书书书　 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜４ ８ ８ ０—２ ０ １ ７ 亨德拉病检疫技术规范 犙狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲 狆狉 狅 狋 狅 犮 狅 犾 犳 狅 狉犎 犲 狀 犱 狉 犪犱 犻 狊 犲 犪 狊 犲 ２ ０ １ ７０ ８２ ９发布 ２ ０ １ ８０ ４０ １实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　本标准按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。本标准修改采用了世界动物卫生组织 （Ｏ Ｉ Ｅ） 《陆生动物诊断试验与疫苗手册 》（２ ０ １ ５版）第２． ９． ６章中亨德拉和尼帕病毒诊断有关章节 。本标准与世界动物卫生组织 （Ｏ Ｉ Ｅ）《陆生动物诊断试验与疫苗手册 》（２ ０ １ ５版）第２． ９． ６章中亨德拉和尼 帕 病 毒 诊 断 等 有 关 章 节 的 主 要 区 别 在 于 对 其 中 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 （Ｅ ｎ ｚｙｍ ｅ  ｌ ｉ ｎ ｋ ｅ ｄｉ ｍｍ ｕ ｎ ｏ ｓ ｏ ｒ ｂ ｅ ｎ ｔａ ｓ ｓ ａ ｙ，Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ）和实时ＲＴ  Ｐ Ｃ Ｒ 检测方法进行了细化 。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 。本标准起草单位 ：中华人民共和国烟台出入境检验检疫局 、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国荣成出入境检验检疫局 。本标准主要起草人 ：尹伟力、孙涛、刘瑶、鲁闽、梁成珠、岳志芹、王群、刘宁。 Ⅰ犛 犖／犜４ ８ ８ ０—２ ０ １ ７ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.亨德拉病检疫技术规范 １　范围 本标准规定了亨德拉病的实时荧光聚合酶链式反应 （Ｒ ｅ ａ ｌ  ｔ ｉ ｍ ｅＰ Ｃ Ｒ ） 、酶联免疫吸附试验 （Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ） 操作的技术规范 。 本标准适用于亨德拉病毒感染的检测和监测 。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｇ Ｂ１ ９ ４ ８ ９ 　实验室生物安全通用要求 ３　生物安全措施 亨德拉病毒对人极具危险 （参见附录 Ａ） 。因此，用于亨德拉病毒检测的相关病料 、组织样品 ，须经 过灭活处理 ，其分子生物学和血清学检测须在二级生物安全实验室中进行 。为了防止疫病传播 ，同时保 护实验人员的安全 ，试验应由具有一定资格的专业技术人员操作 ，所有经前处理的检测病料及样品 、培 养物及废弃物等须经高压灭菌处理 。试验环境和防护要求严格遵守 Ｇ Ｂ１ ９ ４ ８ ９ 。 ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ｃ ＤＮＡ：互补ＤＮＡ（Ｃ ｏ ｍｐｌ ｅ ｍ ｅ ｎ ｔ ａ ｒ ｙＤＮＡ） Ｄ Ｅ Ｐ Ｃ：焦碳酸二乙酯 （Ｄ ｉ ｅ ｔ ｈｙｌｐ ｙｒ ｏ ｃ ａ ｒ ｂ ｏ ｎ ａ ｔ ｅ ） ｄ ＮＴ Ｐ：脱氧核苷三磷酸 （Ｄ ｅ ｏ ｘｙ ｒ ｉ ｂ ｏ ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ｏ ｓ ｉ ｄ ｅｔ ｒ ｉ ｐｈ ｏ ｓｐｈ ａ ｔ ｅ） Ｈ ｅ Ｖ：亨德拉病毒 （Ｈ ｅ ｎ ｄ ｒ ａｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ） Ｍ  ＭＬＶ ：莫洛尼鼠类白血病病毒 （Ｍｏ ｌ ｏ ｎ ｅｙｍ ｕ ｒ ｉ ｎ ｅｌ ｅ ｕ ｋ ｅ ｍ ｉ ａｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ） Ｐ Ｂ Ｓ：磷酸盐缓冲盐水 （Ｐ ｈ ｏ ｓｐｈ ａ ｔ ｅｂ ｕ ｆ ｆ ｅ ｒ ｅ ｄｓ ａ ｌ ｉ ｎ ｅ ） ＲＴ  Ｐ Ｃ Ｒ ：反转录聚合酶链反应 （Ｒ ｅ ｖ ｅ ｒ ｓ ｅｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｃ ｒ ｉ ｐｔ ｉ ｏ ｎ ｐｏ ｌｙｍ ｅ ｒ ａ ｓ ｅｃ ｈ ａ ｉ ｎｒ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ） ５　样品采集与运输 活动物需要采集鼻腔或口腔鼻咽部拭子 、尿液、血清。病死动物需无菌采集脑 、肺、肾和脾脏等组 织。样品需要放于二级生物样品安全转移箱进行运输 。如在４ ８ｈ内能到达实验室 ，则只需保存在 ４℃保存运送到实验室进行检测 ；若运输时间超过 ４ ８ｈ，则样品需在干冰或液氮状态下冰冻运输 ，但病料不 能长期存放在 －２ ０℃。 １犛 犖／犜４ ８ ８ ０—２ ０ １ ７ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.６　荧光犘 犆 犚检测 ６．１　主要试剂 、材料与设备 ６．１．１　病毒ＲＮＡ提取试剂 Ｔ ｒ ｉ ｚ ｏ ｌ、氯仿、异丙醇、无水乙醇 。 ６．１．２　Ｍ  ＭＬＶ 反转录酶 （２ ０ ０Ｕ／μＬ）及相应５×反转录反应缓冲液 、ＲＮＡ酶抑制剂 （４ ０Ｕ／μＬ） 、犜 犪狇酶及相应 １ ０×缓冲液、２ ５ｍｍ ｏ ｌ ／ＬＭｇＣ ｌ２、２． ５ｍｍ ｏ ｌ ／Ｌｄ ＮＴ Ｐ 。 ６．１．３　采用以下引物及探针检测 ：上游引物序列 （Ｆ １） ：５’ ＧＡＴ  ＡＴ Ｉ  ＴＴＴ  ＧＡＭ  ＧＡＧ  Ｇ Ｃ Ｇ  ＧＣ Ｔ  ＡＧＴ  Ｔ  ３ ’ 。下游引物序列 （Ｒ ２） ：５’ Ｃ Ｃ Ｃ  ＡＴ Ｃ  Ｔ ＣＡ  ＧＴＴ  Ｃ ＴＧ  ＧＧＣ  ＴＡＴ  ＴＡＧ  ３ ’ 。 Ｔ ａｇＭ ａ ｎ探针序列 ：５’ ＦＡＭ  Ｃ ＴＡ  Ｃ ＴＴ  ＴＧＡ  Ｃ ＴＡ  Ｃ ＴＡ  ＡＧＡ  ＴＡＡ  ＧＡ  ＴＡＭＲＡ  ３ ’ ６．１．４　高速冷冻离心机 、台式小型离心机 、超净工作台 、混匀器、荧光Ｐ Ｃ Ｒ仪。 ６．２　实验步骤 ６．２．１　样品处理 用于亨德拉病毒检测的相关病料 、组织样品 ，应经过γ射线辐照灭活 （辐照剂量为 ６０ ０ ０Ｇ ｙ）处理后送至二级生物安全实验室 。灭活后的组织样品经研磨匀浆处理 ，加无菌Ｐ Ｂ Ｓ缓冲液（配置见附录 Ｂ） ，制成组织悬液 。 ６．２．２　犚 犖 犃提取 用Ｔ ｒ ｉ ｚ ｏ ｌ法提取ＲＮＡ，也可采用市售的 ＲＮＡ提取试剂盒直接提取病毒 ＲＮＡ。具体步骤如下 ： ａ）　取狀个１． ５ｍＬ 灭菌离心管 ，其中狀为待检样品数 、一管阳性对照及一管阴性对照之和 ，对每个管进行编号标记 。 ｂ）每管加入 ６ ０ ０μＬＴ ｒ ｉ ｚ ｏ ｌ ，然后分别加入待测样本 、阴性对照和阳性对照各 ２ ０ ０μＬ，一份样本换用一个吸头 ；再加入２ ０ ０μＬ氯仿，混匀器上震荡混匀 ５ｓ。于４℃条件下，１ ２０ ０ ０ｒ ／ｒ ｍ ｉ ｎ离心 １ ５ｍ ｉ ｎ。 ｃ）取与样本相同数量的 １． ５ｍＬ 灭菌离心管 ，加入５ ０ ０μＬ异丙醇（－２ ０℃预冷） ，对每个管进行编号。 ｄ）吸取离心后各管中的上清液 ，每个至少吸取 ５ ０ ０μＬ，不要吸出中间层 ，将上清液转移至已加入异丙醇的相应的管中 ，颠倒混匀 。 ｅ）于４℃条件下，１ ２０ ０ ０ｒ ／ｍ ｉ ｎ离心１ ５ｍ ｉ ｎ。轻轻倒去上清 ，倒置于吸水纸上 ，吸干液体 ，不同样品应在吸水纸不同地方吸干 。 ｆ）加入６ ０ ０μＬ７ ５％乙醇，颠倒洗涤 。于４℃条件下，１ ２０ ０ ０ｒ ／ｍ ｉ ｎ离心１ ０ｍ ｉ ｎ，轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上 ，吸干液体 ，不同样品应在吸水纸不同地方吸干 。 ｇ）４０ ０ ０ｒ／ｍ ｉ ｎ离心１ ０ｓ，将管壁上的残余液体甩到管底部 ，用微量加样器尽量将其吸干 ，一份样本换用一个吸头 ，吸头不要碰到有沉淀一面 ，室温干燥 ３ｍ ｉ ｎ。不宜过于干燥 ，以免ＲＮＡ不溶。 ｈ）加入１ １μＬ经无ＲＮＡ酶的灭菌纯化水 ，轻轻混匀 ，溶解管壁上的 ＲＮＡ，２０ ０ ０ｒ／ｍ ｉ ｎ离心５ｓ，冰上保存备用 。提取的ＲＮＡ应在２ｈ内进行荧光 ＲＴ  Ｐ Ｃ Ｒ 扩增或放置于 －７ ０℃冰箱。 ６．２．３　荧光犚 犜  犘 犆 犚 反应体系 该荧光ＲＴ  Ｐ Ｃ Ｒ 以２ ５μＬ体系为例 ，其中每个测试反应体系需要 １ ４μＬＲＴ  Ｐ Ｃ Ｒ 反应液和 ０． ５μＬ ２犛 犖／犜４ ８ ８ ０—２ ０ １ ７ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.Ｍ  ＭＬＶ 反转录酶 ，０． ２ ５μＬＲＮＡ 酶抑制剂以及 ０． ２ ５μＬ犜 犪狇酶。在各设定的 Ｐ Ｃ Ｒ管中分别加入 ６． ２． ２中制备的 ＲＮＡ溶液１ ０μＬ，使总体积达 ２ ５μＬ。盖紧管盖后 ，５ ０ ０ｒ／ｍ ｉ ｎ离心３ ０ｓ。在每次Ｐ Ｃ Ｒ扩增反应板中同时设立阳性对照 、阴性对照及空白对照 。ＲＴ  Ｐ Ｃ Ｒ 反应液配置详见附录 Ｂ。 ６．２．４　犘 犆 犚反应参数 将如上准备好的 Ｐ Ｃ Ｒ反应体系置荧光 Ｐ Ｃ Ｒ仪器，热循环条件按以下参数设置 ： ４ ５℃，３ ０ｍ ｉ ｎ；９ ５℃，１ ０ｍ ｉ ｎ；４ ０个循环的 ９ ５℃，１ ５ｓ，６ ０℃，１ｍ ｉ ｎ，荧光收集设置在第三阶段每次循环的退火延伸时进行 。 ６．２．５　结果判定 如果阳性对照出现典型的扩增曲线 ，且犆ｔ值小于或等于 ３ ５，阴性对照无扩增曲线或 犆ｔ值大于或 等于４ ０，空白对照无扩增 ，则该试验成立 。 当被检测样品有扩增曲线 ，且犆ｔ值小于或等于 ３ ５，那么被检测样品判定为 Ｈ ｅ Ｖ核酸阳性 。 如果被检测样品无扩增曲线 ；犆ｔ值大于或等于 ４ ０，那么被检样品可判定为 Ｈ ｅ Ｖ核酸阴性 。 如果被检测样品有扩增曲线 ，但犆ｔ值在３ ５～４ ０区间内，则判为可疑 ，应重复试验 。如