SN-T 4877.9-2017 基因条形码筛查方法第9部分检疫性腥黑粉菌

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜４８７７．９—２０１７基因条形码筛查方法第９部分：检疫性腥黑粉菌犇犖犃犫犪狉犮狅犱犻狀犵狊犮狉犲犲狀犻狀犵犿犲狋犺狅犱—犘犪狉狋９：犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲犜犻犾犾犲狋犻犪２０１７０８２９发布２０１８０４０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　ＳＮ／Ｔ４８７７《基因条形码筛查方法》分为１０个部分： — — —第１部分：检疫性棒形杆菌； — — —第２部分：检疫性黄单胞菌； — — —第３部分：检疫性植原体； — — —第４部分：检疫性茎点霉； — — —第５部分：检疫性拟茎点霉； — — —第６部分：检疫性嗜酸菌； — — —第７部分：检疫性轮枝菌； — — —第８部分：检疫性炭疽菌； — — —第９部分：检疫性腥黑粉菌； — — —第１０部分：检疫性疫霉。本部分为ＳＮ／Ｔ４８７７的第９部分。本部分按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。本部分主要起草人：程颖慧、章桂明、王颖、高瑞芳、汪莹、潘广、向才玉、冯建军、史亚千、王红英、谢晓露。 Ⅰ犛犖／犜４８７７．９—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.基因条形码筛查方法第９部分：检疫性腥黑粉菌１　范围ＳＮ／Ｔ４８７７的本部分规定了小麦印度腥黑穗病菌犜犻犾犾犲狋犻犪犻狀犱犻犮犪和小麦矮化腥黑穗病菌犜犻犾犾犲狋犻犪犮狅狀狋狉狅狏犲狉狊犪的ＤＮＡ条形码筛查中序列的扩增、分析及结果判定等。本部分适用于小麦印度腥黑穗病菌和小麦矮化腥黑穗病菌的筛查。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ１８０８５　植物检疫　小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法ＧＢ／Ｔ２８０８０　小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定方法３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１犇犖犃条形码　犇犖犃犫犪狉犮狅犱犲生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的ＤＮＡ片段。３．２内部间隔转录区序列　犻狀狋犲狉狀犪犾狋狉犪狀狊犮狉犻犫犲犱狊狆犪犮犲狉；犐犜犛在真核生物中，核糖体ＤＮＡ是由核糖体基因及与之相邻的间隔区组成，其基因组序列从５’到３’依次为：外部转录间隔区、１８Ｓ基因、内部转录间隔区１（ＩＴＳ１）、５．８Ｓ基因、内部转录间隔区２（ＩＴＳ２）、２８Ｓ基因和基因间隔序列。内转录间隔区是存在于１８ＳｒＤＮＡ、５．８ＳｒＤＮＡ和２８ＳｒＤＮＡ之间的区域，ＩＴＳ１和ＩＴＳ２作为非编码区，受外界环境因素的影响较小，与编码区域相比具有进化速度快的特点，在种内的不同菌株之间高度保守，而在真菌种间存在极大的变化，表现出极大的序列多态性，能够提供详尽的系统学分析所需的可遗传性状。４　检疫性腥黑粉菌的基本信息英文名：ＱｕａｒａｎｔｉｎｅＢｕｎｔ学名：Ｔｉｌｌｅｔｉａ犻狀犱犻犮犪中文名：小麦印度腥黑穗病菌学名：犜犻犾犾犲狋犻犪犮狅狀狋狉狅狏犲狉狊犪中文名：小麦矮化腥黑穗病菌分类学地位：真菌界（Ｆｕｎｇｉ）、担子菌门（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、黑粉菌纲（Ｕｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）、黑粉菌目（Ｕｓｔｉ ｌａｇｉｎａｌｅｓ）、腥黑粉菌科（Ｔｉｌｌｅｔｉａｃｅａｅ）、腥黑粉菌属（犜犻犾犾犲狋犻犪）１犛犖／犜４８７７．９—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.５　方法原理利用ＩＴＳ片段作为检疫性病菌的条形码基因，通过对检测对象的ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增及产物测序后，利用生物条形码数据（ＢＯＬＤ）或中国检疫性有害生物ＤＮＡ条形码数据库比对，根据序列相似度筛查物种。６　仪器设备和试剂６．１　仪器设备超净工作台、摇床、烘箱、高压灭菌锅、－２０℃ 低温冰箱、ＰＣＲ扩增仪、冷冻离心机、核酸蛋白分析仪、琼脂糖电泳仪、凝胶成像系统、纯水器。６．２　试剂氯仿、异戊醇、异丙醇、醋酸钠、甲酰胺、７０％乙醇、无水乙醇、Ｔｒｉｓ饱和酚、犜犪狇ＤＮＡ聚合酶、明胶、溴化乙锭、ＤＮＡ片段标记物、ＤＮＡ裂解液、ＰＣＲ缓冲液、电泳缓冲液、上样缓冲液、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、全基因组扩增试剂盒。７　筛查鉴定方法７．１　犇犖犃制备ＤＮＡ制备方法见附录Ａ。７．２　犇犖犃条形码基因片段扩增利用通用引物进行ＩＴＳ片段序列扩增，具体步骤见附录Ｂ。７．３　序列分析测序结果利用序列拼接软件进行拼接编辑，比对峰图，判断序列方向，去除测序引物序列，去除两段测序质量Ｑ值小于２０的序列，然后在生物条形码数据（ＢＯＬＤ）数据库或中国检疫性有害生物ＤＮＡ条形码数据库中比对分析。８　结果判定ＩＴＳ序列长度约为６００ｂｐ。如果测定的序列与美国国家生物技术信息中心（ＮＣＢＩ）数据库中比对（ＡＦ３９９８９０．１，序列参见附录Ｃ）相似度大于９９％时，可初步判定为小麦印度腥黑穗病菌，进一步鉴定按照标准ＧＢ／Ｔ２８０８０进行；如果测定的序列与条码数据库中（ＡＦ３９８４４９．１，序列参见附录Ｃ）比对相似度大于９９％时，可初步判定为小麦矮化腥黑穗病菌，进一步鉴定按照标准ＧＢ／Ｔ１８０８５进行。９　菌种或标本保存９．１　样品保存分离到的检疫性腥黑粉菌菌种，转入马铃薯葡萄糖琼脂（ＰＤＡ）试管斜面培养基上，置于４℃黑暗２犛犖／犜４８７７．９—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.条件下保存至少１２个月，以备复验、谈判和仲裁。获取的菌瘿或菌瘿碎片等标本，密封保存，保存至少１２个月，以备复验、谈判和仲裁。９．２　结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。ＰＣＲ凝胶电泳检测需有电泳结果照片，序列需要保存电子文件。３犛犖／犜４８７７．９—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.附　录　犃（规范性附录）犇犖犃制备犃．１　单个孢子犇犖犃获取菌瘿中冬孢子获取方法：用针刺破菌瘿，挑取不带植物组织的少许孢子，将这些孢子轻轻展布于载玻片上，在低倍镜下观察孢子是否分散开，再将单个孢子挑起，直接转移到ＰＣＲ管的管盖中，在低倍镜下确认孢子是否已被成功放置。孢子悬浮液中冬孢子获取方法：用显微操作系统（或在倒置显微镜下人工操作）从孢子悬浮液中吸取孢子，所用毛细管孔径为１００μｍ，整个操作过程在检测器上进行监控，也可在显微镜下直接进行观察，确认孢子已被吸入毛细管内并被转移到ＰＣＲ管的管盖内。用破壁针对放置在ＰＣＲ管盖中的孢子实施破壁：在１０×低倍镜下用破壁针头轻轻挤压孢子，促使孢子壁破裂，使孢子中的核酸释放出来，在显微镜下检测孢子壁是否已经被压破。快速将ＰＣＲ反应混合液加到ＰＣＲ管盖中，振荡混匀，然后离心，置于冰上，振荡后离心。用全基因组扩增试剂盒对单个孢子ＤＮＡ进行扩增，扩增产物作为原始ＤＮＡ。犃．２　孢子培养物犇犖犃提取犃．２．１　孢子萌发挑取冬孢子，置于２％水琼脂培养基上，１８℃～２０℃、每日连续光照１２ｈ条件下培养１０ｄ，解剖镜下检查萌发情况。对萌发的孢子用接种针挑取置于ＰＤＡ培养基上，２０℃～２２℃培养２０ｄ。犃．２．２　孢子培养物的核酸制备称取０．１ｇ培养物，放在无菌的多层滤纸上，吸去水分，置于无菌的研钵中，用液氮冷冻，用研磨棒将它们研成粉末。立即转移到２ｍＬ的离心管中，加入６５℃预热的ＤＮＡ裂解液（ＳＤＳ）提取液７００μＬ，置于水浴锅中６５℃水浴３０ｍｉｎ，期间不断混匀。加入５μＬ１０ｍｇ／ｍＬＲＮＡ酶，充分混匀，在３７℃放置３０ｍｉｎ。加入等体积的Ｔｒｉｓ饱和酚，充分摇匀，在１２０

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