SN-T 4877.8-2017 基因条形码筛查方法第8部分检疫性炭疽菌

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜４８７７．８—２０１７基因条形码筛查方法第８部分：检疫性炭疽菌犇犖犃犫犪狉犮狅犱犻狀犵狊犮狉犲犲狀犻狀犵犿犲狋犺狅犱—犘犪狉狋８：犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲犮狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犽犪犺犪狑犪犲２０１７０８２９发布２０１８０４０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　ＳＮ／Ｔ４８７７《基因条形码筛查方法》分为１０个部分： — — —第１部分：检疫性棒形杆菌； — — —第２部分：检疫性黄单胞菌； — — —第３部分：检疫性植原体； — — —第４部分：检疫性茎点霉； — — —第５部分：检疫性拟茎点霉； — — —第６部分：检疫性嗜酸菌； — — —第７部分：检疫性轮枝菌； — — —第８部分：检疫性炭疽菌； — — —第９部分：检疫性腥黑粉菌； — — —第１０部分：检疫性疫霉。本部分为ＳＮ／Ｔ４８７７的第８部分。本部分按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国宁波出入境检验检疫局。本部分主要起草人：程颖慧、章桂明、高瑞芳、王颖、史亚千、汪莹、段维军、向才玉、潘广、王红英、谢晓露。 Ⅰ犛犖／犜４８７７．８—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.基因条形码筛查方法第８部分：检疫性炭疽菌１　范围ＳＮ／Ｔ４８７７的本部分规定了咖啡浆果炭疽病菌　犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犽犪犺犪狑犪犲ＤＮＡ条形码筛查中序列的扩增、分析及结果判定等。本部分适用于进境植物及植物产品中咖啡浆果炭疽病菌的ＤＮＡ条形码的筛查。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＳＮ／Ｔ３６７９　咖啡浆果炭疽病菌检疫鉴定方法３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１犇犖犃条形码　犇犖犃犫犪狉犮狅犱犲生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的ＤＮＡ片段。３．２甘油醛３磷酸脱氢酶　犵犾狔犮犲狉犪犾犱犲犺狔犱犲 ３狆犺狅狊狆犺犪狋犲犱犲犺狔犱狉狅犵犲狀犪狊犲；犌犃犘犇犎糖酵解反应中的一个酶，分子量１４６ｋＤａ，为管家基因，几乎在所有组织中都高水平表达。在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定。４　咖啡浆果炭疽病菌的基本信息英文名：ｐａｔｈｏｇｅｎｏｆｃｏｆｆｅｅｂｅｒｒｙｄｉｓｅａｓｅ学名：犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犽犪犺犪狑犪犲Ｊ．Ｍ．ＷａｌｌｅｒｅｔＢｒｉｄｇｅ异名：犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犮狅犳犳犲犪狀狌犿ｖａｒ．狏犻狉狌犾犪狀狊（Ｒａｙｎｅｒ，１９５２）分类学地位：真菌界（Ｆｕｎｇｉ），无性型真菌（Ａｎａｍｏｒｐｈｉｃｆｕｎｇｉ），炭疽菌属（犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿）。５　方法原理使用ＧＡＰＤＨ基因作为咖啡浆果炭疽病菌的ＤＮＡ条码基因，通过对检测对象的ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增及产物测序后，利用ＮＣＢＩ核酸数据库比对，根据序列相似度筛查物种。１犛犖／犜４８７７．８—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.６　仪器设备和试剂６．１　仪器设备超净工作台、摇床、烘箱、高压灭菌锅、－２０℃ 低温冰箱、ＰＣＲ扩增仪、冷冻离心机、核酸蛋白分析仪、琼脂糖电泳仪、凝胶成像系统、纯水器。６．２　试剂氯仿、异戊醇、异丙醇、醋酸钠、甲酰胺、７０％乙醇、无水乙醇、Ｔｒｉｓ饱和酚、犜犪狇ＤＮＡ聚合酶、明胶、溴化乙锭、ＤＮＡ片段标记物、ＤＮＡ裂解液、ＰＣＲ缓冲液、电泳缓冲液、上样缓冲液、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）。７　筛查鉴定方法７．１　犇犖犃制备ＤＮＡ制备方法见附录Ａ。７．２　犇犖犃条形码片段犘犆犚扩增利用ＧＡＰＤＨ基因的通用引物进行ＧＡＰＤＨ基因序列扩增，具体步骤见附录Ｂ，测序。７．３　序列分析测序结果利用序列拼接软件进行拼接编辑，比对峰图，判断序列方向，去除测序引物序列，去除两段测序质量Ｑ值小于２０的序列。利用美国国家生物技术信息中心（ＮＣＢＩ）在线数据库中比对ＧＡＰＤＨ基因序列（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）。８　结果判定序列长度约为２８０ｂｐ，序列与美国国家生物技术信息中心（ＮＣＢＩ）数据库中（ＦＪ９７２５８４．１）比对相似度大于９９％时，即可筛查初步判定为咖啡浆果炭疽病菌，咖啡浆果炭疽病菌的ＧＡＰＤＨ基因参考序列参见附录Ｃ。进一步鉴定按ＳＮ／Ｔ３６７９进行。９　菌种保存９．１　样品保存分离到的咖啡浆果炭疽病菌菌种，转入麦芽提取物琼脂（ＭＥＡ）试管斜面培养基上，置于４℃黑暗条件下保存至少１２个月，以备复验、谈判和仲裁。９．２　结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。ＰＣＲ凝胶电泳检测需有电泳结果照片，序列需要保存电子文件。２犛犖／犜４８７７．８—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.附　录　犃（规范性附录）犇犖犃制备犃．１　核酸制备称取０．１ｇ培养物，放在无菌的多层滤纸上，吸去水分，置于无菌的研钵中，用液氮冷冻，用研磨棒将它们研成粉末；立即转移到２ｍＬ的离心管中，加入６５℃预热的ＤＮＡ裂解液（ＳＤＳ）提取液７００μＬ，置于水浴锅中６５℃水浴３０ｍｉｎ，期间不断混匀；加入５μＬ１０ｍｇ／ｍＬＲＮＡ酶，充分混匀，在３７℃放置３０ｍｉｎ；加入等体积的Ｔｒｉｓ饱和酚，充分摇匀，在１２０００ｒ／ｍｉｎ下离心１５ｍｉｎ；取上清液，加入１∶１氯仿异戊醇（２４∶１），在１２０００ｒ／ｍｉｎ下离心１５ｍｉｎ；再取上清液，加入１∶１氯仿异戊醇（２４∶１），在１２０００ｒ／ｍｉｎ下离心１５ｍｉｎ；加入等体积预冷的异丙醇，轻轻摇晃，置于－２０℃ 冰箱静置３０ｍｉｎ，在１２０００ｒ／ｍｉｎ下离心１５ｍｉｎ；弃上清，加入７０％乙醇５００μＬ，１２０００ｒ／ｍｉｎ下离心３ｍｉｎ，去上清，重复２次；得到ＤＮＡ沉淀，用冷冻干燥仪进行干燥，加入３０μＬ～５０μＬＴＥ或无菌去离子水，充分溶解后，测量ＤＮＡ的纯度和浓度后置于－２０℃冰箱中保存。注：该核酸制备也可采用ＤＮＡ提取试剂盒法或ＣＴＡＢ法等。犃．２　犇犖犃浓度及纯度测定用核酸蛋白分析仪测定ＤＮＡ的纯度与浓度，分别取得２６０ｎｍ和２８０ｎｍ处的吸收值，计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下：ＤＮＡ纯度＝ＯＤ２６０／ＯＤ２８０ＤＮＡ浓度＝５０×ＯＤ２６０（μｇ／ｍＬ）ＰＣＲ级ＤＮＡ溶液的ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比值为１．７～１．９。３犛犖／犜４８７７．８—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.附　录　犅（规范性附录）扩增程序犅．１　引物序列ＧＤＦ：５’ ＧＣＣＧＴＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＴＴＣＡＴＴＧＡ  ３ ’ ＧＤＲ：５’ ＧＧＧＴＧＧＡＧＴＣＧＴＡＣＴＴＧＡＧＣＡＴＧＴ  ３ ’ 犅．２　扩增体系及条件扩增反应的组成成分为：１０×ＰＣＲ缓冲液５μＬ，１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰＳ０．２５ μＬ，１０μｍｏｌ／Ｌ前后向引物各２．５μＬ，５Ｕ／μＬ犜犪狇酶０．２５μＬ，模板ＤＮＡ５μＬ，补充去离子水至５０μＬ。将反应体系混匀后置于ＰＣＲ仪中进行反应。反应用双蒸水作空白对照，阳性对

SN-T 4877.8-2017 基因条形码筛查方法 第8部分 检疫性炭疽菌

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