书书书　 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜４ ８ ７ ７．７—２ ０ １ ７ 基因条形码筛查方法第７部分：检疫性轮枝菌 犇 犖 犃犫 犪 狉 犮 狅 犱 犻 狀 犵狊 犮 狉 犲 犲 狀 犻 狀犵犿 犲 狋 犺 狅 犱—犘 犪 狉 狋７：犙狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲 犞 犲 狉 狋 犻 犮 犻 犾 犾 犻 狌 犿 ２ ０ １ ７０ ８２ ９发布 ２ ０ １ ８０ ４０ １实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　Ｓ Ｎ／Ｔ４ ８ ７ ７《基因条形码筛查方法 》分为１ ０部分： — — —第１部分：检疫性棒形杆菌 ； — — —第２部分：检疫性黄单胞菌 ； — — —第３部分：检疫性植原体 ； — — —第４部分：检疫性茎点霉 ； — — —第５部分：检疫性拟茎点霉 ； — — —第６部分：检疫性嗜酸菌 ； — — —第７部分：检疫性轮枝菌 ； — — —第８部分：检疫性炭疽菌 ； — — —第９部分：检疫性腥黑粉菌 ； — — —第１ ０部分：检疫性疫霉 。本部分为 Ｓ Ｎ／Ｔ４ ８ ７ ７的第７部分。本部分按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 。本部分起草单位 ：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局 、深圳市检验检疫科学研究院 。本部分起草人 ：高瑞芳、章桂明、汪莹、程颖慧、王颖、卢小雨、向才玉、潘广。 Ⅰ犛 犖／犜４ ８ ７ ７．７—２ ０ １ ７ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.基因条形码筛查方法第７部分：检疫性轮枝菌 １　范围 Ｓ Ｎ／Ｔ４ ８ ７ ７的本部分规定了棉花黄萎病菌和苜蓿黄萎病菌 ＤＮＡ条形码筛查中序列的扩增 、分析及结果判定等 。本部分适用于检疫性轮枝菌的 ＤＮＡ条形码筛查 。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。Ｇ Ｂ／Ｔ２ ８ ０ ８ ４ 　棉花黄萎病菌检疫检测与鉴定Ｓ Ｎ／Ｔ１ １ ４ ５　苜蓿黄萎病检疫鉴定方法 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。３．１犇 犖 犃条形码　犇 犖 犃犫 犪 狉 犮 狅 犱 犲生物体内能够代表该物种的 ，标准的、有足够变异的 、易扩增且相对较短的 ＤＮＡ片段。３．２内部转录间隔区序列 　犻 狀 狋 犲 狉 狀 犪 犾 狋 狉 犪 狀 狊 犮 狉 犻 犫 犲 犱狊 狆犪 犮 犲 狉；犐 犜 犛在真核生物中 ，核糖体ＤＮＡ是由核糖体基因及与之相邻的间隔区组成 ，其基因组序列从 ５’到３’依次为：外部转录间隔区 、１ ８Ｓ基因、内部转录间隔区 １（Ｉ Ｔ Ｓ １） 、５． ８Ｓ基因、内部转录间隔区 ２（Ｉ Ｔ Ｓ ２） 、２ ８Ｓ基因和基因间隔序列 。内转录间隔区是存在于 １ ８Ｓｒ ＤＮＡ 、５． ８Ｓｒ ＤＮＡ 和２ ８Ｓｒ ＤＮＡ 之间的区域，Ｉ Ｔ Ｓ １和Ｉ Ｔ Ｓ ２作为非编码区 ，受外界环境因素的影响较小 ，与编码区域相比具有进化速度快的特点 ，在种内的不同菌株之间高度保守 ，而在真菌种间存在极大的变化 ，表现出极大的序列多态性 ，能够提供详尽的系统学分析所需的可遗传性状 。 ４　检疫性轮枝菌基本信息 学名：犞 犲 狉 狋 犻 犮 犻 犾 犾 犻 狌 犿犱 犪 犺 犾 犻 犪 犲 Ｋ ｌ ｅ ｂ中文名：棉花黄萎病菌学名：犞 犲 狉 狋 犻 犮 犻 犾 犾 犻 狌 犿犪 犾 犫 狅  犪 狋 狉 狌 犿 Ｒ ｅ ｉ ｎ ｋ ｅｅ ｔＢ ｅ ｒ ｔ ｈ ｏ ｌ ｄ中文名：苜蓿黄萎病菌分类地位 ：真菌界（Ｆ ｕ ｎｇｉ） ，丝孢纲（Ｈｙ ｐｈ ｏ ｍｙｃ ｅ ｔ ｅ ｓ） ，丝孢目（Ｈｙ ｐｈ ｏ ｍｙｃ ｅ ｔ ａ ｌ ｅ ｓ） ，淡色孢科 （Ｍｏ ｎ ｉ ｌ ｉ ａ ｃ ｅ ａ ｅ） ，轮枝孢属 （犞 犲 狉 狋 犻 犮 犻 犾 犾 犻 狌 犿 ）寄主范围参见附录 Ａ。 ５　方法原理 使用Ｉ Ｔ Ｓ片段作为棉花黄萎病菌和苜蓿黄萎病菌的 ＤＮＡ条形码基因 ，通过对检测对象的 ＤＮＡ进 １犛 犖／犜４ ８ ７ ７．７—２ ０ １ ７ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.行Ｐ Ｃ Ｒ扩增及产物测序后 ，利用ＤＮＡ条形码数据库生物条形码数据 （ＢＯＬ Ｄ）或中国检疫性有害生物ＤＮＡ条形码数据库比对 ，根据序列相似度筛查物种 。 ６　仪器设备和试剂 ６．１　仪器设备 超净工作台 、高压灭菌锅 、４℃冰箱、Ｐ Ｃ Ｒ扩增仪、冷冻离心机 、核酸蛋白分析仪 、琼脂糖电泳仪 、凝胶成像系统 。 ６．２　试剂 Ｃ ＴＡＢ提取液、三氯甲烷 、乙醇、Ｐ Ｃ Ｒ犜 犪狇ＤＮＡ聚合酶、Ｐ Ｃ Ｒ犜 犪狇缓冲液、ｄ ＮＴ Ｐ、ＤＮＡ标记物、无菌超纯水 。 ７　筛查鉴定方法 ７．１　犇 犖 犃提取与纯化 对真菌进行液体培养或平板培养 ，Ｃ ＴＡＢ法对基因组 ＤＮＡ的提取方法详见附录 Ｂ，测定ＤＮＡ浓度及纯度后 ，保存于－２ ０℃冰箱备用 。 ７．２　犇 犖 犃条形码片段 犘 犆 犚扩增 利用通用引物进行 Ｉ Ｔ Ｓ片段序列扩增 （具体步骤参见附录 Ｃ） ，测序。 ７．３　序列分析 测序结果利用 Ｂ ｉ ｏ Ｅ ｄ ｉ ｔ 等生物信息学软件进行剪接编辑 ，比对峰图和正反向测序结果是否有误 ，去掉两端引物部分序列 ，然后在ＢＯＬ Ｄ数据库或中国检疫性有害生物 ＤＮＡ条形码数据库中比对分析 。 ８　结果判定 Ｉ Ｔ Ｓ序列长度 ５ ０ ０ｂｐ左右，在生物条形码数据库 ＢＯＬ Ｄ和中国检疫性有害生物 ＤＮＡ条形码数据库中进行比对 ，若与ＤＮＡ条码数据库中检疫性轮枝菌序列相似度大于 ９ ９％时，即可以筛查判定是该物种。棉花黄萎病菌和苜蓿黄萎病菌 ＤＮＡ条形码参考序列参见附录 Ｄ。若判定为目标检疫性轮枝菌 ，应结合Ｇ Ｂ／Ｔ２ ８ ０ ８ ４ 和Ｓ Ｎ／Ｔ１ １ ４ ５进行最终鉴定 。 ９　样品保存 ９．１　样品保存 分离得到的菌种转移到马铃薯葡萄糖斜面培养基上 ，置于４℃黑暗条件下保存至少 １ ２个月，以备复验、谈判和仲裁 。 ９．２　结果记录与资料保存 完整的实验记录包括 ：样品的来源 、种类、时间，实验的时间 、地点、方法和结果等 ，并要有实验人员和审核人员签字 。Ｐ Ｃ Ｒ凝胶电泳检测需有电泳结果照片 ，序列需要保存电子文件 。 ２犛 犖／犜４ ８ ７ ７．７—２ ０ １ ７ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.附　录　犃（资料性附录 ） 苜蓿黄萎病菌和棉花黄萎病菌寄主范围 苜蓿黄萎病菌 （犞 犲 狉 狋 犻 犮 犻 犾 犾 犻 狌 犿犪 犾 犫 狅  犪 狋 狉 狌 犿 Ｒ ｅ ｉ ｎ ｋ ｅｅ ｔＢ ｅ ｒ ｔ ｈ ｏ ｌ ｄ ）的主要寄主有苜蓿 、蚕豆、马铃薯、草莓、冠状岩黄芪 、红花菜豆等 。棉花黄萎病菌 （犞 犲 狉 狋 犻 犮 犻 犾 犾 犻 狌 犿犱 犪 犺 犾 犻 犪 犲 Ｋ ｌ ｅ ｂ）的主要寄主有棉花 、向日葵、茄子、辣椒、番茄、烟草、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜、花生、菜豆、绿豆、大豆、芝麻、甜菜等。 ３犛 犖／犜４ ８ ７ ７．７—２ ０ １ ７ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.附　录　犅（规范性附录 ） 基因组犇 犖 犃制备 犅．１　犇 犖 犃制备 实验器皿于 １ ２ １℃、３ ０ｍ ｉ ｎ 湿热灭菌或 １ ８ ０℃干热灭菌 １ｈ。从培养基上 ，刮取１ ０ ０ｍｇ左右的菌丝体至研钵内 ，加入液氮充分研磨 ，加入４ｍＬ预热的Ｃ ＴＡＢ抽提液。将离心管放入水浴锅前先振荡 １ｍ ｉ ｎ，然后放入 ６ ５℃水浴锅水浴 １ ５ｍ ｉ ｎ，每隔３ｍ ｉ ｎ～５ｍ ｉ ｎ振荡 １次。加三氯甲烷 ４ｍＬ，用移液器混匀 １ｍ ｉ ｎ，水浴１ ０ｍ ｉ ｎ；４℃，１ ２０ ０ ０犵离心１ ５ｍ ｉ ｎ，取上清液加等体积异丙醇 ，轻轻摇匀 ，然后－２ ０℃静置１ ５ｍ ｉ ｎ。 ４℃，１ ２０ ０ ０犵离心１ ５ｍ ｉ ｎ，小心去除上清液 ，留沉淀；加７ ０％预冷酒精 ，洗涤３次，放于通风处干燥；加入５ ０μＬ～１ ０ ０μＬ灭菌的去离子水溶解 ＤＮＡ。 犅．２　犇 犖 犃浓度及纯度测定 用核酸蛋白分析仪测定 ＤＮＡ的纯度与浓度 ，分别取得 ２ ６ ０ｎ ｍ 和２ ８ ０ｎ ｍ 处的吸收值 ，计算核酸的纯度和浓度 ，计算公式如下 ： ＤＮＡ纯度＝ＯＤ ２ ６ ０／ＯＤ２ ８ ０ＤＮＡ浓度＝５ ０×ＯＤ ２ ６ ０μｇ／ｍＬＰ Ｃ Ｒ级ＤＮＡ溶液的ＯＤ２ ６ ０／ＯＤ２ ８ ０比值为１． ７～１． ９。 ４犛 犖／犜４ ８ ７ ７．７—２ ０ １ ７ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.附　录　犆（资料性附录 ） 犐 犜 犛片段扩增流程 犆．１　犘 犆 犚 犆．１．１　引物序列 Ｉ Ｔ Ｓ ４：Ｔ Ｃ Ｃ Ｔ Ｃ Ｃ ＧＣ ＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧ ＣＩ Ｔ Ｓ ５：ＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴ Ｃ ＧＴＡＡＣＡＡＧＧ 犆．１．２　扩增体系及条件 扩增反应的组成成分为 ： １ ０×Ｐ Ｃ Ｒ 缓冲液 ５μＬ ……………………………… ２． ５ｍｍ ｏ ｌ ／Ｌｄ Ｎ