SN-T 4877.15-2019 基因条形码筛查方法第15部分检疫性叶点霉

书书书犐犆犛６５．０２０．０１犅１６中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜４８７７．１５—２０１９基因条形码筛查方法第１５部分：检疫性叶点霉犇犖犃犫犪狉犮狅犱犻狀犵狊犮狉犲犲狀犻狀犵犿犲狋犺狅犱—犘犪狉狋１５：犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲犘犺狔犾犾狅狊狋犻犮狋犪狊狆狆．２０１９０９０３发布２０２００３０１实施中华人民共和国海关总署发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本部分依据ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。本部分起草单位：宁波检验检疫科学技术研究院、中华人民共和国宁波海关、中国科学院微生物研究所、中国检验检疫科学研究院。本部分主要起草人：段维军、蔡磊、郭立新、陈倩、段丽君、李雪莲、刘芳、赵文军、陈先锋。 Ⅰ犛犖／犜４８７７．１５—２０１９SN/T 4877《基因条形码筛查方法》分为15个部分： ——第1部分：检疫性棒形杆菌； ——第2部分：检疫性黄单胞菌； ——第3部分：检疫性植原体； ——第4部分：检疫性茎点霉； ——第5部分：检疫性拟茎点霉； ——第6部分：检疫性嗜酸菌； ——第7部分：检疫性轮枝菌； ——第8部分：检疫性炭疽菌； ——第9部分：检疫性腥黑粉菌； ——第10部分：检疫性疫霉； ——第11部分：检疫性异株苋亚属； ——第12部分：黄瓜绿斑驳花叶病毒； ——第13部分：检疫性马铃薯Y病毒属病毒； ——第14部分：检疫性南方菜豆花叶病毒属病毒； ——第15部分：检疫性叶点霉。本部分为 SN/T 4877的第 15部分。 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.基因条形码筛查方法第１５部分：检疫性叶点霉１　范围本部分规定了检疫性叶点霉ＤＮＡ条形码筛查方法。本部分适用于进境植物及其产品中检疫性叶点霉的筛查。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＳＮ／Ｔ２５８９　植物病原真菌检测规范３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１　检疫性叶点霉属真菌葡萄苦腐病菌犌狉犲犲狀犲狉犻犪狌狏犻犮狅犾犪（Ｂｅｒｋ．ｅｔＭ．Ａ．Ｃｕｒｔｉｓ）Ｐｕｎｉｔｈａｌｉｎｇａｍ（现用名为犘犺狔犾犾狅狊狋犻犮狋犪犪犿  狆犲犾犻犮犻犱犪（Ｅｎｇｅｌｍ．）Ａａ，曾用名犌狌犻犵狀犪狉犱犻犪犫犻犱狑犲犾犾犻犻（Ｅｌｌｉｓ）Ｖｉａｌａ＆Ｒａｖａｚ和犘犺狅犿犪狌狏犻犮狅犾犪Ｂｅｒｋ．＆Ｍ．Ａ．Ｃｕｒｔｉｓ）。分类地位：叶点霉属（犘犺狔犾犾狅狊狋犻犮狋犪）、球壳孢科（Ｐｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａｃｅａｅ）、葡萄座腔菌目（Ｂｏｔｒｙｏ ｓｐｈａｅｒｉａｌｅｓ）、座囊菌纲（Ｄｏｔｈｉｄｅｏｍｙｃｅｔｅｓ）、子囊菌门（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）。３．２　凭证标本（犞狅狌犮犺犲狉狊狆犲犮犻犿犲狀）凭证标本是一种为鉴定或研究提供实物依据并具有足够存档信息（采集及鉴定信息等）而长期保存的标本，它可以是完整的生物个体或其一部分，也可以是生物体的遗传物质。凭证标本的保存需要有详细的标本编号、存放地点等详细信息，以便于日后查证。３．３　犇犖犃条形码（犇犖犃犫犪狉犮狅犱犲）ＤＮＡ条形码是指生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的ＤＮＡ片段。研究人员用ＤＮＡ条形码技术鉴定物种及物种间亲缘关系，修改已有的分类学结论等。用于鉴定检疫性叶点霉属的ＤＮＡ条形码如下：核糖体基因转录间隔区（ＩｎｔｅｒｎａｌＴｒａｎｓｃｒｉｂｅｄＳｐａｃｅｒ，简称ＩＴＳ）４　方法原理根据叶点霉属真菌的核糖体转录间隔区（ＩＴＳ）的序列特征，应用ＤＮＡ条形码技术对检疫性叶点霉进行种类筛查，确定目标真菌是否为检疫性叶点霉及其种属归类。１犛犖／犜４８７７．１５—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.５　仪器用具和试剂５．１　仪器设备与用具显微镜、高压灭菌锅、超净工作台、组织破碎仪、恒温水浴锅、台式冷冻离心机、微量分光光度仪、电子天平、超纯水仪、漩涡振荡器、冰箱、微量移液器（０．５μＬ，２．５μＬ，１０μＬ，２０μＬ，２００μＬ，１０００μＬ）、常规ＰＣＲ仪、核酸电泳仪、凝胶成像系统、ＤＮＡ提取仪。５．２　主要试剂购置如下试剂或者相应的真菌基因组提取试剂盒：乙二胺四乙酸钠盐（Ｎａ２ＥＤＴＡ·２Ｈ２Ｏ）、氢氧化钠（ＮａＯＨ）、Ｔｒｉｓ碱、浓盐酸（ＨＣｌ）、溴化十六烷基三甲铵（ＣＴＡＢ）、氯化钠（ＮａＣｌ）、聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰ）、冰醋酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）、蒸馏水、氯仿（ＣＨＣｌ３）、异戊醇、７０％乙醇。ＰＣＲ和电泳检测所需试剂：１０×ＰＣＲ缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸（ｄＮＴＰｓ）、ＥｘＴａｑ聚合酶、引物、超纯水、ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ、琼脂糖、ＧｅｌＲｅｄ核酸凝胶染料。６　筛查鉴定方法６．１　样品的采集与处理样品的采集、分离、纯化和培养参照ＳＮ／Ｔ２５８９植物病原真菌检疫鉴定方法进行。６．２　核酸的制备采用基因组提取试剂盒制备ＤＮＡ，或采用改良的ＣＴＡＢ提取法，参见附录Ａ。６．３　犇犖犃纯度与浓度的测定用微量紫外分光光度计测定ＤＮＡ的纯度与浓度，分别取得２６０ｎｍ和２８０ｎｍ处的吸收值，计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下：ＤＮＡ纯度＝ＯＤ２６０／ＯＤ２８０ＤＮＡ浓度＝５０×ＯＤ２６０ μｇ／ｍＬＰＣＲ级ＤＮＡ溶液的ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比值应为１．７～１．９。６．４　序列扩增测序利用通用引物对ＩＴＳ基因进行扩增测序（具体步骤见附录Ｂ），将序列在Ｇｅｎｂａｎｋ数据库或中国检疫性有害生物ＤＮＡ条形码数据库中进行比对，若与数据库中叶点霉属ＩＴＳ基因序列相似性均大于９８％，则比对分析序列同源性。７　结果判定ＩＴＳ基因序列长度大于５００ｂｐ，在ＮＣＢＩ数据库或中国检疫性有害生物ＤＮＡ条形码数据库中进行比对分析，若与数据库中叶点霉属ＩＴＳ基因序列（参见附录Ｃ）同源性大于９８％，则判定该菌为叶点霉属。若测定序列与附录Ｄ检疫性叶点霉ＩＴＳ参考序列同源性为１００％，则判定该菌为葡萄苦腐病菌。２犛犖／犜４８７７．１５—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.８　保存８．１　样品保存分离并最终鉴定为检疫性目标真菌的菌株应转接到试管斜面上，经登记和经手人签字后置于４℃低温冰箱中保存，定期（３０ｄ～６０ｄ）转接，必要时冻干后长期保存。８．２　结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。ＰＣＲ凝胶电泳检测需有电泳结果照片，序列需要保存电子文件。３犛犖／犜４８７７．１５—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.附　录　犃（资料性附录）犇犖犃提取方法犃．１　取适量菌丝体（５００ｍｇ）和灭菌的玻璃珠放在２ｍＬ离心管中，加入５００μＬ２×ＣＴＡＢ（６０℃），置于组织破碎仪上破碎组织细胞壁，水浴保温３０～６０ｍｉｎ，偶尔震荡混匀；犃．２　加入５００μＬ（１∶１，等体积）氯仿／异戊醇（２４∶１），混合均匀后（３ｍｉｎ），１２０００ｒｐｍ，离心１５ｍｉｎ；犃．３　提取上清液，加入２５０μＬ（１∶１，等体积）氯仿／异戊醇（２４∶１），１２０００ｒｐｍ，离心１５ｍｉｎ；重复此步骤一次；犃．４　提取上清液，加入等体积异丙醇，混匀，沉淀３０ｍｉｎ；犃．５　出现沉淀后，１２０００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ；犃．６　弃去液相，加入４００μＬ７０％乙醇，震荡洗涤，再１２０００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ；重复此步骤一次；犃．７　弃去液相，超净工作台中干燥ＤＮＡ，约２０ｍｉｎ；犃．８　加入５０或１００μＬ双蒸水（视情况而定）溶解ＤＮＡ样品，将样

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