书书书犐 犆 犛６ ５．０ ２ ０犅１ ６ 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜４ ８ ７ ７．１ ４—２ ０ １ ９ 基因条形码筛查方法第１ ４部分：检疫性南方菜豆花叶病毒属病毒 犇 犖 犃犫 犪 狉 犮 狅 犱 犻 狀 犵狊 犮 狉 犲 犲 狀 犻 狀犵犿 犲 狋 犺 狅 犱—犘 犪 狉 狋１ ４：犙狌 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲 犛 狅 犫 犲 犿 狅 狏 犻 狉 狌 狊 犲 狊 ２ ０ １ ９０ ９０ ３发布 ２ ０ ２ ００ ３０ １实施 中华人民共和国海关总署 发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　本部分按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口 。本部分起草单位 ：中华人民共和国北京海关 、中华人民共和国厦门海关 。本部分主要起草人 ：邓丛良，陈红运、赵晓丽、吕玉峰、骆卫峰、刘兴亮、郑春生。 Ⅰ犛 犖／犜４ ８ ７ ７．１ ４—２ ０ １ ９SN/ T 4877《 基因条形码筛查方法 》分为15个部分： ——第1部分：检疫性棒形杆菌； ——第2部分：检疫性黄单胞菌； ——第3部分：检疫性植原体； ——第4部分：检疫性茎点霉； ——第5部分：检疫性拟茎点霉； ——第6部分：检疫性嗜酸菌； ——第7部分：检疫性轮枝菌； ——第8部分：检疫性炭疽菌； ——第9部分：检疫性腥黑粉菌； ——第10部分：检疫性疫霉； ——第11部分：检疫性异株苋亚属； ——第12部分：黄瓜绿斑驳花叶病毒 ； ——第13部分：检疫性马铃薯Y病毒属病毒； ——第14部分：检疫性南方菜豆花叶病毒属病毒； ——第15部分：检疫性叶点霉。 本部分为 SN/T 4877的第 1 4 部分。 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.基因条形码筛查方法第１ ４部分：检疫性南方菜豆花叶病毒属病毒 １　范围 本部分规定了检疫性南方菜豆花叶病毒属病毒的基因条形码筛查方法中 ＲＮＡ提取、基因扩增 、序 列的比对分析及结果判定等 。 本部分适用于植物繁殖材料及植物产品中检疫性南方菜豆花叶病毒属病毒的筛查检测 。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｓ Ｎ／Ｔ３ ４ ３ ８　南方菜豆花叶病毒检疫鉴定方法 。 Ｓ Ｎ／Ｔ３ ４ ３ ６　藜草花叶病毒检疫鉴定方法 。 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 犇 犖 犃条形码（犇 犖 犃犫 犪 狉 犮 狅 犱 犲 ） ＤＮＡ条形码是指生物体内能够代表该物种的 、标准的、有足够变异的 、易扩增且相对较短的 ＤＮＡ片段。 ４　南方菜豆花叶病毒属基本信息 中文名称 ：南方菜豆花叶病毒属 学　　名：ｇｅ ｎ ｕ ｓ犛 狅 犫 犲 犿 狅 狏 犻 狉 狌 狊该属病毒可侵染单子叶植物和双子叶植物 ，但每个病毒的自然寄主范围相对窄 ，病害症状主要是花 叶和斑驳 。该属有１ ３个种和３个暂定种 ，该属病毒包括南方菜豆花叶病毒 （犛 狅 狌 狋 犺 犲 狉 狀犫 犲 犪 狀犿 狅 狊 犪 犻 犮 狏 犻 狉 狌 狊，Ｓ ＢＭＶ）和藜草花叶病毒 （犛 狅 狑 犫 犪 狀 犲犿 狅 狊 犪 犻 犮狏 犻 狉 狌 狊 ，Ｓ ｏＭＶ）等２种检疫性植物病毒 。有关该病毒 属的其他信息参见附录 Ａ。 ５　原理 南方菜豆花叶病毒属 （犛 狅 犫 犲 犿 狅 狏 犻 狉 狌 狊 ）的成员为正义单链 ＲＮＡ病毒。病毒复制酶基因的保守区域 即为该属的条形码特征序列 ，根据此保守区域设计简并引物 ，进行ＲＴ  Ｐ Ｃ Ｒ 扩增和Ｐ Ｃ Ｒ产物测序 ，实 现对犛 狅 犫 犲 犿 狅 狏 犻 狉 狌 狊 病毒的筛查检测 。 １犛 犖／犜４ ８ ７ ７．１ ４—２ ０ １ ９ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.６　仪器和试剂 ６．１　仪器与设施 酶联检测仪 、电子天平 （感量０． ０ ０ ０１ｇ） 、定性Ｐ Ｃ Ｒ仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统 、恒温水浴 、低 温冰箱、普通冰箱 、离心机等 ；微量移液器 （２． ５μＬ，１ ０μＬ，２ ０μＬ，１ ０ ０μＬ，２ ０ ０μＬ，１０ ０ ０μＬ） ；酶联板、研 钵等；隔离温室 。 ６．２　试剂 试剂见附录 Ｂ。 ７　制样 挑取畸形 、不成熟的种子播于灭菌土中 ，待长出３  ４片真叶后将表现症状的植株编号 ，未表现症状 的植株分组 （１ ０株为１组）并编号。 ８　犇 犖 犃条形码筛查 分别提取样品和对照的总 ＲＮＡ，反转录合成 ｃ ＤＮＡ后，进行Ｐ Ｃ Ｒ扩增。健康的植物组织作阴性对 照，感染Ｓ ＢＭＶ的植物组织作阳性对照 ，用无菌水作空白对照 。 具体操作见附录 Ｂ。 ９　结果判定 ９．１　通用ＲＴ  Ｐ Ｃ Ｒ 方法检测结果为阴性 ，则判定未检出南方菜豆花叶病毒属病毒 。 ９．２　通用ＲＴ  Ｐ Ｃ Ｒ 方法检测结果为阳性 ，则进行序列测定与分析 ： ａ）　如果翻译后氨基酸序列与南方菜豆花叶病毒属已知病毒序列 （参见附录 Ｃ）同源性大于 ９ ５％， 则判定检出南方菜豆花叶病毒属病毒 （具体病毒种类还需采用其他方法进一步鉴定 ） 。 ｂ）　如果翻译后氨基酸序列与南方菜豆花叶病毒属已知病毒序列同源性低于 ９ ５％： — — —如果系统发育分析表明与南方菜豆花叶病毒属病毒聚为一群 ，则判定检出南方菜豆花叶 病毒属病毒 （具体病毒种类还需采用其他方法进一步鉴定 ） ； 　　注：所检测到的病毒可能属于基因组序列尚未测定的已知病毒或尚未报道的新的病毒种类 。 — — —如果系统发育分析表明与南方菜豆花叶病毒属病毒未聚为一群 ，则判定未检出南方菜豆 花叶病毒属病毒 。 ｃ）　如果测定的基因组序列与南方菜豆花叶病毒属中的 Ｓ ＢＭＶ和Ｓ ｏＭＶ病毒同源性最高 ，则判定 筛查出检疫性植物病毒 ，需要根据标准方法 （Ｓ Ｎ／Ｔ３ ４ ３ ８ 和Ｓ Ｎ／Ｔ３ ４ ３ ６）进行最终鉴定 。 １ ０　样品保存 、结果记录与资料保存 １ ０．１　结果记录与资料保存 记录样品信息和检测数据 ，包括样品来源 、植物种类 、取样时间与地点 ，检测时间 、方法和结果以及 ２犛 犖／犜４ ８ ７ ７．１ ４—２ ０ １ ９ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.人员签字 。ＲＴ  Ｐ Ｃ Ｒ 检测方法应保存电泳照片 ，测序结果保存测序报告图 。 １ ０．２　样品保存 检出南方菜豆花叶病毒属病毒样品应妥善保存在超低温冰箱中 ，或冻干后低温保存 ，并作好登记和 标识，以备复核 。 ３犛 犖／犜４ ８ ７ ７．１ ４—２ ０ １ ９ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.附　录　犃（资料性附录 ） 南方菜豆花叶病毒属简介 犃．１　病毒粒体形态 南方菜豆花叶病毒属病毒毒粒子为等轴对称的二十面体 （Ｔ＝３） ，无包膜，直径约３ ０ｎ ｍ，有１ ８ ０个蛋白亚基 ，每个蛋白亚基有两个区域一个形成二十面体外壳约 ３． ５ｎ ｍ 厚的部分 ，另一个在病毒内形成部分顺序的 “臂” 。 犃．２　基因组特性 所有犛 狅 犫 犲 犿 狅 狏 犻 狉 狌 狊 病毒的基因组均为 １条多顺反子 、正义、单链ＲＮＡ，由４个开放阅读框架 （ｏｐｅ ｎｒ ｅ ａ ｄ ｉ ｎｇｆ ｒ ａ ｍ ｅ，ＯＲ Ｆ）组成：ＯＲ Ｆ １、ＯＲ Ｆ２ ａ 和ＯＲ Ｆ２ ｂ 都是由基因组 ＲＮＡ翻译产生的 ，其中ＯＲ Ｆ２ ａ是通过渗漏扫描机制而表达的 ；ＯＲ Ｆ２ ｂ 通过 １核糖体移码机制 ，与ＯＲ Ｆ２ ａ 形成１个融合蛋白 ；ＯＲ Ｆ ３是由亚基因组 ＲＮＡ翻译产生的 。编码复制酶的模体位于 ＯＲ Ｆ２ ｂ 内。 犃．３　病毒种类 蓝莓带化病毒 （犅 犾 狌 犲 犫 犲 狉 狉 狔狊 犺 狅 犲 狊 狋 狉 犻 狀 犵狏 犻 狉 狌 狊，Ｂ Ｓ Ｓ Ｖ）鸭茅斑驳病毒 （犆 狅 犮 犽 狊犳狅 狅 狋犿 狅 狋 狋 犾 犲狏 犻 狉 狌 狊 ，Ｃ ｆ ＭＶ）白茅黄斑驳病毒 （犐 犿狆犲 狉 犪 狋 犪狔犲 犾 犾 狅 狑 犿 狅 狋 狋 犾 犲狏 犻 狉 狌 狊 ，Ｉ ＹＭＶ）紫花苜蓿暂时性线条病毒 （犔 狌 犮 犲 狉 狀 犲狋 狉 犪 狀 狊 犻 犲 狀 狋 狊 狋 狉 犲 犪 犽狏 犻 狉 狌 狊 ，Ｌ Ｔ Ｓ Ｖ）水稻黄斑驳病毒 （犚 犻 犮 犲狔犲 犾 犾 狅 狑 犿 狅 狋 狋 犾 犲狏 犻 狉 狌 狊 ，ＲＹＭＶ）黑麦草斑驳病毒 （犚狔犲犵狉 犪 狊 狊犿 狅 狋 狋 犾 犲狏 犻 狉 狌 狊 ，ＲＧＭｏ Ｖ ）田菁花叶病毒 （犛 犲 狊 犫 犪 狀 犻 犪犿 狅 狊 犪 犻 犮狏 犻 狉 狌 狊 ，Ｓ ｅ ＭＶ）节花茄斑驳病毒 （犛 狅 犾 犪 狀 狌 犿狀 狅 犱 犻 犳犾 狅 狉 狌 犿 犿 狅 狋 狋 犾 犲狏 犻 狉 狌 狊 ，Ｓ ＮＭｏ Ｖ ）南方菜豆花叶病毒 （犛 狅 狌 狋 犺 犲 狉 狀犫 犲 犪 狀犿 狅 狊 犪 犻 犮狏 犻 狉 狌 狊 ，Ｓ ＢＭＶ）南方豇豆花叶病毒 （犛 狅 狌 狋 犺 犲 狉 狀犮 狅 狑 狆犲 犪犿 狅 狊 犪 犻 犮狏 犻 狉 狌 狊 ，Ｓ Ｃ ＰＭＶ ）藜草花叶病毒 （犛 狅 狑 犫 犪 狀 犲犿 狅 狊 犪