书书书犐 犆 犛６ ５．０ ２ ０犅１ ６ 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜４ ８ ７ ７．１ ３—２ ０ １ ９ 基因条形码筛查方法第１ ３部分：检疫性马铃薯 犢病毒属病毒 犇 犖 犃犫 犪 狉 犮 狅 犱 犻 狀 犵狊 犮 狉 犲 犲 狀 犻 狀犵犿 犲 狋 犺 狅 犱—犘 犪 狉 狋１ ３：犙狌 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲犘 狅 狋 狔狏 犻 狉 狌 狊 犲 狊 ２ ０ １ ９０ ９０ ３发布 ２ ０ ２ ００ ３０ １实施 中华人民共和国海关总署 发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　本部分按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口 。本部分起草单位 ：中华人民共和国北京海关 、中华人民共和国青岛海关 。本部分主要起草人 ：邓丛良，刘兴亮、张丽杰、王英超、赵晓丽、骆卫峰、郑春生。 Ⅰ犛 犖／犜４ ８ ７ ７．１ ３—２ ０ １ ９SN/ T 4877《 基因条形码筛查方法 》分为15个部分： ——第1部分：检疫性棒形杆菌； ——第2部分：检疫性黄单胞菌； ——第3部分：检疫性植原体； ——第4部分：检疫性茎点霉； ——第5部分：检疫性拟茎点霉； ——第6部分：检疫性嗜酸菌； ——第7部分：检疫性轮枝菌； ——第8部分：检疫性炭疽菌； ——第9部分：检疫性腥黑粉菌； ——第10部分：检疫性疫霉； ——第11部分：检疫性异株苋亚属； ——第12部分：黄瓜绿斑驳花叶病毒 ； ——第13部分：检疫性马铃薯Y病毒属病毒； ——第14部分：检疫性南方菜豆花叶病毒属病毒； ——第15部分：检疫性叶点霉。 本部分为 SN/T 4877的第 1 3 部分。 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.基因条形码筛查方法第１ ３部分：检疫性马铃薯 犢病毒属病毒 １　范围 本部分规定了检疫性马铃薯 Ｙ病毒属病毒的基因条形码筛查方法中 ＲＮＡ提取、基因扩增 、序列的 比对分析及结果判定等 。 本部分适用于寄主植物中马铃薯 Ｙ病毒属中检疫性病毒的筛查 。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｓ Ｎ／Ｔ２ １ ２ ２　进出境植物及植物产品检疫抽样 。 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 犇 犖 犃条形码（犇 犖 犃犫 犪 狉 犮 狅 犱 犲 ） ＤＮＡ条形码是指生物体内能够代表该物种的 、标准的、有足够变异的 、易扩增且相对较短的 ＤＮＡ 片段。 ４　马铃薯犢病毒属基本信息 中文名称 ：马铃薯Ｙ病毒属 学　　名：犵犲 狀 狌 狊犘 狅 狋 狔狏 犻 狉 狌 狊马铃薯Ｙ病毒属属于马铃薯 Ｙ病毒科（犘 狅 狋狔狏 犻 狉 犻 犱 犪 犲 ） ，是已知最大的植物病毒属之一 ，占到已知植 物病毒的 ２ ０％以上，其代表种是马铃薯 Ｙ病毒（犘 犪 狋 犪 狋 狅狏 犻 狉 狌 狊犢 ，Ｐ ＶＹ） 。该属病毒包括香蕉苞片花叶 病毒（犅 犪 狀 犪 狀 犪犫 狉 犪 犮 狋犿 狅 狊 犪 犻 犮狏 犻 狉 狌 狊 ，Ｂ Ｂ ｒ ＭＶ ） 、李痘病毒 （犘 犾 狌 犿狆狅 狓狏 犻 狉 狌 狊 ，Ｐ Ｐ Ｖ） 、马铃薯Ａ病毒（犘 狅 狋 犪 狋 狅 狏 犻 狉 狌 狊Ａ，Ｐ ＶＡ）和马铃薯 Ｖ病毒（犘 狅 狋 犪 狋 狅狏 犻 狉 狌 狊 Ａ，Ｐ ＶＶ）４种检疫性植物病毒 。有关该病毒属的其他信 息参见附录 Ａ。 ５　方法原理 以马铃薯 Ｙ病毒属病毒的基因组序列中的保守区域设计合成简并引物 ，建立该病毒属病毒基因条 形码筛查方法 ；并对Ｐ Ｃ Ｒ产物进行序列测定 ，通过序列分析确定病毒种类 。因此，马铃薯Ｙ病毒属的 分子生物学特征是制定本检测鉴定方法的主要依据 。 １犛 犖／犜４ ８ ７ ７．１ ３—２ ０ １ ９ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.６　仪器设备与试剂 ６．１　仪器设备与用具 研磨仪，微量天平 （感量：０． ０ ０ １ｇ） ，Ｐ Ｃ Ｒ仪，电泳仪，水平电泳槽 ，凝胶成像仪 ，高速冷冻台式离心机，水浴槽或恒温孵育器 ，ｐＨ计，各种量程的可调移液器 （１０ ０ ０μＬ、２ ０ ０μＬ、１ ０ ０μＬ、２ ０μＬ、１ ０μＬ、 ２μＬ）等。 ６．２　试剂 试剂见附录 Ｂ。 ７　筛查鉴定方法 ７．１　抽样检查 按照Ｓ Ｎ／Ｔ２ １ ２ ２给出的方法进行抽样 、取样。 ７．２　犚 犜  犘 犆 犚 方法 按附录Ｂ给出的方法 ，进行通用 ＲＴ  Ｐ Ｃ Ｒ 检测。用已知病毒分离物作阳性对照 ，健康植物组织作阴性对照 ，并设置空白对照 。 ７．３　序列测定与分析 将Ｐ Ｃ Ｒ产物回收后 ，进行克隆 、测序，或者Ｐ Ｃ Ｒ产物直接测序 （序列测定可由专业的生物公司完成） 。把测定的核苷酸序列及翻译后的氨基酸序列与已知马铃薯 Ｙ病毒属的病毒序列 （参见附录 Ｃ）进行比对。采用邻接法 （或者利用 ＭＥ ＧＡ ６ 的Ｎ Ｊ算法）构建系统发育树 。 　　注：序列比对可利用 ＮＣ Ｂ Ｉ网站上的 Ｂ ＬＡ Ｓ Ｔ 软件进行 ，网址为ｈ ｔ ｔｐ： ／ ／ｗｗｗ． ｎ ｃ ｂ ｉ ． ｎ ｌ ｍ． ｎ ｉ ｈ． ｇｏ ｖ／Ｂ ＬＡ Ｓ Ｔ／ ８　结果判定 ８．１　ＲＴ  Ｐ Ｃ Ｒ 方法检测结果为阴性 ，则判定未检出马铃薯 Ｙ病毒属病毒 。 ８．２　ＲＴ  Ｐ Ｃ Ｒ 方法检测结果为阳性 ，则进行序列测定与分析 ： ａ）　如果翻译后氨基酸序列与马铃薯 Ｙ病毒属已知病毒氨基酸序列同源性最高且大于 ８ ０％，则判定检出马铃薯 Ｙ病毒属病毒 （具体病毒种类还需采用其他方法进一步鉴定 ） 。 ｂ）　如果翻译后氨基酸序列与马铃薯 Ｙ病毒属已知病毒序列同源性小于 ８ ０％： — — —如果系统发育分析表明与马铃薯 Ｙ病毒属病毒聚为一群 ，则判定检出马铃薯 Ｙ病毒属病毒（具体病毒种类还需采用其他方法进一步鉴定 ） ； 　　注：所检测到的病毒可能属于基因组序列尚未测定的已知病毒或尚未报道的新的病毒种类 。 — — —如果系统发育分析表明与马铃薯 Ｙ病毒属病毒未聚为一群 ，则判定未检出马铃薯 Ｙ病毒属病毒。 ｃ）　如果测定的基因组序列与马铃薯 Ｙ病毒属中的 Ｐ Ｐ Ｖ、Ｐ ＶＡ、Ｐ Ｐ Ｖ和Ｂ Ｂ ｒ ＭＶ 中植物病毒基因组序列同源性最高 ，则判定筛查出检疫性植物病毒 ，需要根据具体病毒的检疫鉴定标准方法进行最终鉴定到种 。 ２犛 犖／犜４ ８ ７ ７．１ ３—２ ０ １ ９ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.９　结果记录 记录样品信息和检测数据 ，包括样品来源 、植物种类 、取样时间与地点 ，检测时间 、方法和结果以及人员签字 。ＲＴ  Ｐ Ｃ Ｒ 凝胶电泳检测应保存电泳照片 ，测序结果保存测序报告图 。 １ ０　样品保存 检出马铃薯 Ｙ病毒属的样品应妥善保存在超低温冰箱中 ，或冻干后低温保存 ，并作好登记和标识 ，以备复核 。 ３犛 犖／犜４ ８ ７ ７．１ ３—２ ０ １ ９ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.附　录　犃（资料性附录 ） 马铃薯犢病毒属基本信息 犃．１　病毒粒体形态 马铃薯Ｙ病毒属的病毒粒体为线状粒子 ，通常长约 ６ ８ ０～９ ０ ０ｎ ｍ，直径１ ２～１ ５ｎ ｍ，螺旋对称结构 ，螺距约３． ４ｎ ｍ。该属病毒外壳蛋白由一种多肽组成 ，分子量为 ２ ８～３ ８ｋ Ｄ ａ，占整个病毒粒体 ９ ５％的重量（图Ａ． １） 。 图犃．１　马铃薯犢病毒属病毒的粒体结构 （ｈ ｔ ｔｐ： ／ ／ｖ ｉ ｒ ａ ｌ ｚ ｏ ｎ ｅ ． ｅ ｘ ｐａ ｓｙ． ｏ ｒｇ／ａ ｌ ｌ＿ｂｙ＿ｓｐｅ ｃ ｉ ｅ ｓ／５ ０． ｈ ｔ ｍ ｌ ） 犃．２　病毒的基因组结构与功能 马铃薯Ｙ病毒属病毒为单分体正单链 ＲＮＡ病毒，全长约１ ０Ｋ ｂ，在ＲＮＡ基因组的 ５ ′末端共价连接一个蛋白质 ，称Ｖ Ｐｇ（Ｖ ｉ ｒ ａ ｌｐｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ，ｇｅ ｎ ｏ ｍ ｅ  ｌ ｉ ｎ ｋ ｅ ｄ ） ，约２ ４ ｋ Ｄ ａ，３ ′末端具有一个 ｐｏ ｌｙ（Ａ）尾，５ ′和３ ′末端各有一段非翻译区 （ＵＴＲ） ；整个基因组的第一个可读框编码一个大的多聚蛋白 （ｐｏ ｌｙ ｐｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ） ，经过翻译加工成具有不同功能的蛋白 。加工后的成熟蛋白从 Ｎ端到Ｃ端依次为 ：Ｐ １蛋白、ＨＣ  Ｐ ｒ ｏ 蛋白、 Ｐ ３蛋白、６ Ｋ １蛋白、Ｃ Ｉ蛋白、６ Ｋ ２蛋白、Ｖ Ｐｇ蛋白、Ｎ Ｉ ａ蛋白、Ｎ Ｉ ｂ蛋白和外壳蛋白 Ｃ Ｐ（Ｈ ａ ｒ ｉ，１ ９ ８ １； Ｄ ｏ ｕｇｈ ｅ ｒ ｔｙａ ｎ ｄＣ ａ ｒ ｒ ｉ ｎ ｇｔ ｏ ｎ，１ ９ ８ ８；Ｍｕ ｒｐｈｙｅ ｔａ ｌ ．，１ ９ ９ ５） 。其中三个病毒基因组自身编码的蛋白 （Ｐ １、 ＨＣ  Ｐ ｒ ｏ 和Ｎ Ｉ ａ蛋白）为具有自我切割和切割其他蛋白能力的蛋白酶 ，且其切割位点具有一定的特异性 （Ｄ ｏ ｕｇｈ ｅ ｒ ｔｙａ ｎ ｄＳ ｅ ｍ ｌ ｅ ｒ ，１ ９ ９ ３） 。最新研究表明 ，马铃薯Ｙ病毒科病毒还编码一个短的可读框 ，位于Ｐ ３顺反子中 ，它由＋２读框翻译 ，其编