以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4876.8 —2020 代替 SN/T 1162— 2002 DNA 条形码方法　第 8 部分：菟丝子属 Method for DNA barcoding —— Part 8: Cuscuta spp. 中华人民共和国海关总署 发 布ICS 65.020.01 CCS B 16 2020 -12-30发布 2021 -07-01 实施以正式出版文本为准以正式出版文本为准I SN/T 4876.8—2020前 言 本文件按照 GB/T 1.1— 2020 的规定起草。 SN/T 4876《DNA 条形码方法》为系列标准，已发布以下部分：——第 1 部分：检疫性乳白蚁——第 2 部分：检疫性断眼天牛——第 3 部分：检疫性卷蛾——第 4 部分：检疫性高梁属——第 5 部分：曼陀罗属 ——第 6 部分：瘤背豆象属 ——第 7 部分：一品红亚属——第 8 部分：莬丝子属本文件为 SN/T 4876 的第 8 部分本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位： 中华人民共和国福州海关、中华人民共和国上海海关、中华人民共和国宁波海 关、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国青岛海关、中华人民共和国广州海关、中华人民共和国南京海关。 本文件主要起草人： 于文涛、印丽萍、王念武、虞赟、傅怡宁、徐瑛、范晓虹、邵秀玲、吴海 荣、薛华杰、伏建国。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 4876.8—2020DNA 条形码方法　菟丝子属 1　范围 本文件规定了菟丝子属的 DNA 条形码检测鉴定方法。 本文件适用于国境口岸开展菟丝子属分子鉴定的植物检疫实验室。 2　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 SN/T 1385　菟丝子属的检疫鉴定方法 3　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1　　　DNA 条形码　DNA barcode 一段短的、标准化的基因片段，用于区分不同的物种。该片段在种间存在明显的遗传变异和分 化，并容易进行 PCR 扩增。DNA 条形码技术主要用于物种识别和新种发现。3.2　　凭证标本　voucher specimen 一种为鉴定或研究提供实物依据并具有足够存档信息（采集及鉴定信息等）而长期保存的标本， 它可以是完整的生物个体或其一部分，也可以是生物体的遗传物质。凭证标本记录的存档信息应具有追溯性。凭证标本的保存非常重要，是 DNA 条形码的实物参考凭证，凭证标本信息包括馆藏信息、采集信息、鉴定信息，用于复核。3.3　　　核基因组核糖体 DNA　nuclear ribosome DNA；nrDNA 真核生物细胞核染色体所包含的全部遗传信息，即碱基对，有别于诸如叶绿体和线粒体的质体 DNA，以及黏粒及质粒等其他 DNA 存在形式。3.4　　叶绿体 DNA　chloroplast DNA；cpDNA 存在于叶绿体内的 DNA。高等植物叶绿体的 DNA 为双链共价闭合环状分子，其长度因生物种类 而不同，其大小在 120 kb 到 217 kb 之间，相当于噬菌体基因组的大小。3.5　　内部转录间隔区　internal transcribed spacer；ITS 在真核生物核核糖体 DNA 中，18S rRNA 和 28S rRNA 基因间隔序列称为内转录间隔区。内转 录间隔区所在的核糖体基因组序列从 5 ’到3 ’依次为：外部转录间隔区（external transcribed spacer， ETS） 、18S 基因、内部转录间隔区 1（ITS1） 、5.8S 基因、内部转录间隔区 2 （ITS2） 、28S 基因和基因间隔序列（intergenic spacer，IGS） 。即，内转录间隔区包含 ITS1、5.8S 基因和 ITS2。核糖体 RNA 中以正式出版文本为准2 SN/T 4876.8—2020的 18S、5.8S 和 28S 的基因组序列在大多数生物中趋于保守，在生物种间变化小，而内转录间隔区 ITS1 和 ITS2 作为非编码区，承受的选择压力较小，相对变化较大，并且能够提供详尽的系统学分析所需要的可遗传性状。3.6　　1,5 -二磷酸核酮糖羧化酶大亚基基因　RubisCo_large ； rbcL 1,5 -二磷酸核酮糖羧化酶（ RubisCo）是一种具有羧化和加氧双重功能的酶，在光合作用和光呼 吸中都起着重要的作用。RubisCo 酶由 16 个亚基组成，包括 8 个大亚基和 8 个小亚基。其中大亚基 基因（rbcL）由叶绿体基因组编码。 4　菟丝子属植物基本信息 中文名：菟丝子属 学名： Cuscuta spp. 分 类 地 位： 被 子 植 物 门（Magnoliophyta） ， 木 兰 纲（Magnoliatae） ， 茄 目（Solanales） ， 旋 花 科 （Convolvulaceae） 菟丝子属植物为寄生草本，无根，全体不被毛。茎缠绕，细长，线形，黄色或红色，不为绿色， 借助吸器固着寄主。无叶，或退化成小的鳞片。花小，白色或淡红色，无梗或有短梗，成穗状、总状或簇生成头状的花序；苞片小或无；花 5～4 出数；萼片近于等大，基部或多或少连合；花冠管状、壶状、球形或钟状，在花冠管内面基部雄蕊之下具有边缘分裂或流苏状的鳞片；雄蕊着生于花冠喉部或花冠裂片相邻处，通常稍微伸出，具短的花丝及内向的花药；花粉粒椭圆形，无刺；子房 2 室，每室 2 胚珠，花柱 2，完全分离或多少连合，柱头球形或伸长。蒴果球形或卵形，有时稍肉质，周裂或不规则破裂。种子 1 ～4，无毛；胚在肉质的胚乳之中，线状，成圆盘形弯曲或螺旋状，无子叶或稀 具细小的鳞片状的遗痕。本属植物约 170 种，广泛分布于全世界暖温带，主产美洲。 菟丝子属植物易随寄主及其产品传播，其为可造成严重经济损失又难以防除的恶性杂草，因此 世界上许多国家把其列为禁止或限制输入的有害生物。 5　总体原则 本标准建立的方法不应完全取代形态学鉴定方法，而应与形态学鉴定方法 SN/T 1385 互为补充， 相互佐证。6　方法原理 根据菟丝子属的 ITS 序列和 rbcL 基因特征，应用 DNA 条形码技术对菟丝子属植物进行筛查鉴定。 7　仪器用具和试剂7.1　仪器及用具 常规 PCR 仪、微量分光光度仪、电泳仪、凝胶成像系统、测序仪、高速冷冻离心机、生物安全 柜、烘箱、高压灭菌锅、显微镜、解剖镜、天平（1/10 000 g） 、研钵、摇床、水浴锅、制冰机、纯 水仪、旋涡振荡器、冰箱、冷冻混合研磨仪、微量移液器（2 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、 1 000 μL） 、离心管（2 mL） 、PCR 反应管（0.2 mL、0.5 mL） 。以正式出版文本为准3 SN/T 4876.8—20207.2　主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。 植物基因组提取试剂盒、超纯水、DNA Marker、琼脂糖、核酸凝胶染料、液氮、脱氧核糖核苷 三磷酸（dNTPs） 、 Taq聚合酶、10×PCR 缓冲液。CTAB 法提取试剂（参见附录 A 中 A.1） 。 8　筛查鉴定方法 8.1　样品的处理 使用形态学方法无法完全判定的疑似菟丝子属植物及其近似属的植物材料，将需要提取 DNA 的 植物材料（种子为 1 ～2 粒，硅胶干燥的茎为 10 mg） ，放入 2 mL 的 EP 管中，每个管内加 2 粒钢珠， 加液氮后使用冷冻混合研磨仪研磨 3 min（30 r/s） 。 8.2　核酸的制备 采用商品化的植物基因组提取试剂盒或采用改良的 CTAB 法提取植物基因组总 DNA。改良的 CTAB 法方法参见附录 A 中 A.2。 PCR 级 DNA 溶液的 OD260 /OD280比值应为 1.7～1.9。 8.3　DNA 条形码片段扩增 利用 ITS 序列和 rbcL 基因的通用引物进行 ITS 序列和 rbcL 基因扩增，引物序列、反应程序和反 应体系见附录 B。 8.4　PCR 产物的检测 取 PCR 产物 5 μL，1.5% 琼脂糖凝胶电泳，核酸凝胶染料染色，在凝胶成像系统观察、拍照。 ITS 引物扩增可获得约 600 bp 的扩增片段，rbcL 引物扩增可获得约 700 bp 的扩增片段。 8.5　测序与序列处理 取剩余的 PCR 扩增产物 45 μL，经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳分离，目的片段使用 DNA 产物纯化试剂 盒纯化并测序。测序引物与 PCR 扩增引物相同。 测序结果利用序列拼接软件进行拼接编辑，对比峰图，判断序列方向，去除测序引物序列，两 端测序质量 Q 值小于 20 的序列去除。 9　结果判定9.1　中国检疫性有害生物 DNA 条形码鉴定系统判定 登录中国检疫性有害生物 DNA 条形码鉴定系统（http://www.iplant.cn/ias/dna） ，点击“物种识别” 导航条，进入物种识别页面。 在鉴定框内输入 FASTA 格式 （或纯文本格式） 序列后，点击 “提交鉴定” ， 系统进行 BLAST 后，自动生成鉴定结果。如相似度最高的 10 条序列为菟丝子属序列，且最大相似度在 98% 以上，可明确判定为菟丝子属（参见附录 C） 。 9.2　植物有害生物检疫鉴定系统判定 登录植物有害生物检疫鉴定系统（http://www.pestchina.com/sitePag