SN-T 4876.7-2019 DNA条形码方法第7部分一品红亚属

书书书犐犆犛６５．０２０．０１犅１６中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜４８７６．７—２０１９犇犖犃条形码方法　第７部分：一品红亚属犕犲狋犺狅犱犳狅狉犇犖犃犫犪狉犮狅犱犲 —犘犪狉狋７：犛狌犫犵犲狀．犘狅犻狀狊犲狋狋犻犪２０１９０９０３发布２０２００３０１实施中华人民共和国海关总署发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本部分按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。本部分起草单位：宁波检验检疫科学技术研究院，中华人民共和国南京海关动植物与食品检测中心，中华人民共和国上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，中华人民共和国广州海关，中国检验检疫科学研究院，中华人民共和国福州海关，中华人民共和国青岛海关。本部分起草人：徐瑛，伏建国，印丽萍，张吉红，张慧丽，傅艺宁，吴海荣，范晓红，于文涛，宋涛。 Ⅰ犛犖／犜４８７６．７—２０１９SN/T 4876《 DNA条形码方法》分为7个部分： ——第1部分：检疫性乳白蚁； ——第2部分：检疫性断眼天牛； ——第3部分：检疫性卷蛾； ——第4部分：检疫性高粱属； ——第5部分：曼陀罗属； ——第6部分：瘤背豆象属； ——第7部分：一品红亚属。本部分为 SN/T 4876的第 7部分。 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.犇犖犃条形码方法　第７部分：一品红亚属１　范围本部分规定了大戟属一品红亚属常见种的ＤＮＡ条形码检测方法。本部分适用于大戟属一品红亚属常见种的ＤＮＡ条形码的测定、结果的比对分析与判定。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ３２１４２　齿裂大戟检疫鉴定方法３　术语与定义下列术语与定义适用于本文件。３．１　犇犖犃条形码　犇犖犃犫犪狉犮狅犱犲狊ＤＮＡ条形码是一段短的、标准化的基因片段，用于区分不同的物种。该片段在种间存在明显的遗传变异和分化并容易进行ＰＣＲ扩增。３．２　内部转录间隔区２　犻狀狋犲狉狀犪犾狋狉犪狀狊犮狉犻犫犲犱狊狆犪犮犲狉２，简称犐犜犛２在真核生物核糖体ＲＮＡ中，１８ＳｒＲＮＡ和２８ＳｒＲＮＡ基因间隔序列称为（ＩＴＳ），其所在的核糖体基因组序列从５’到３’依次为：外部转录间隔区（ｅｘｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｓｐａｃｅｒ，ＥＴＳ）、１８Ｓ基因、内部转录间隔区１（ＩＴＳ１）、５．８Ｓ基因、内部转录间隔区２（ＩＴＳ２）、２８Ｓ基因和基因间隔序列（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃｓｐａｃｅｒ，ＩＧＳ）。核糖体ＲＮＡ中的１８Ｓ、５．８Ｓ和２８Ｓ的基因组序列在大多数生物中趋于保守，在生物种间变化小，而内转录间隔区ＩＴＳ１和ＩＴＳ２作为非编码区，承受的选择压力较小，相对变化较大，并且能够提供详尽的系统学分析所需要的可遗传性状。本标准选用引物的扩增区域包括５．８Ｓ部分序列，ＩＴＳ２全序列和２８Ｓ部分序列，扩增总长度约４４９ｂｐ，其中齿裂大戟ＩＴＳ２长度为２１９ｂｐ。３．３　狀犱犺犉基因又称叶绿体ＮＡＤＨ脱氢酶复合体Ｆ亚基基因　ＣｈｌｏｒｏｐｌａｓｔＮＡＤＨｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓｕｂｕｎｉｔＦ，位于叶绿体基因组的小单拷贝区，定位于类囊体ＮＤＨ复合体疏水臂末端。为编码假定的叶绿体ＮＡＤＨ脱氢酶的一个亚基。本标准扩增区是位于狀犱犺Ｆ的５３８和１３１８间的一段，扩增去除引物后长度约７２７ｂｐ。４　一品红亚属基本信息分类地位：大戟科Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ，大戟属犈狌狆犺狅狉犫犻犪犔．，一品红亚属犘狅犻狀狊犲狋狋犻犪。大戟属是被子植物中特大属之一，约２０００种，遍布世界各地，其中以非洲和中南美洲较多；我国检１犛犖／犜４８７６．７—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.疫性有害生物名单中大戟属仅一种 — — —齿裂大戟（犈狌狆犺狅狉犫犻犪犱犲狀狋犪狋犪Ｍｉｃｈｘ），归入一品红亚属，根据Ｍａｙｆｉｅｌｄ（１９９７）对大戟属一品红亚属的分类处理，该亚属在全球约２４种，大部分为局部分布，有的甚至为稀有物种，除齿裂大戟外常见种还包括戴维大戟（犈．犱犪狏犻犱犻犻Ｓｕｂｉｌｓ），猩猩草（犈．犮狔犪狋犺狅狆犺狅狉犪Ｍｕｒ ｒａｙ），白苞猩猩草（犈．犺犲狋犲狉狅狆犺狔犾犾犪Ｌ．）、一品红（犈．狆狌犾犮犺犲狉狉犻犿犪ＷｉｌｌｄｅｎｏｗｅｘＫｌｏｔｚｓｃｈ）。其中齿裂大戟、戴维大戟和白苞猩猩草为有害杂草，一品红和猩猩草为园林植物。近似种信息详见ＧＢ／Ｔ３２１４２。５　方法原理根据植物ＩＴＳ２和狀犱犺Ｆ的序列特征，应用ＤＮＡ条形码技术对大戟属一品红亚属常见种进行鉴定。６　仪器设备和主要试剂６．１　仪器设备与用具ＰＣＲ仪、电子天平（感量０．００１ｇ）、冷冻混合研磨仪、电泳仪、凝胶成像系统、高速冷冻离心机、解剖镜、涡旋振荡器、冰箱、水浴锅、测序仪、高压灭菌锅、可调式微量移液器（２μＬ、１０μＬ、２０μＬ、１００μＬ、２００μＬ，１０００μＬ）及相应吸头、离心管、ＰＣＲ管等。６．２　主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。植物基因组提取试剂盒、超纯水、ＤＮＡＭａｒｋｅｒ、琼脂糖、核酸凝胶染料、液氮、脱氧核糖核苷三磷酸（ｄＮＴＰｓ）、Ｔａｑ酶、１０×ＰＣＲ缓冲液、１０×加样缓冲液，５０×ＴＡＥ缓冲液、引物（见附录Ｂ．１）。ＣＴＡＢ法提取试剂（参见附录Ａ．１）。７　筛查鉴定方法７．１　样品的处理样品鉴定见ＧＢ／Ｔ３２１４２。将需要提取ＤＮＡ的植物材料（种子为１粒 ２粒，硅胶干燥的叶片为１０ｍｇ），放入２ｍＬ圆底离心管中，每个管内加２粒钢珠，加液氮后使用冷冻混合研磨仪研磨３ｍｉｎ（３０次／秒）。７．２　犇犖犃制备使用商品化的植物基因组提取试剂盒或采用改良的ＣＴＡＢ法提取植物基因组总ＤＮＡ。改良的ＣＴＡＢ法方法参见附录Ａ．２。７．３　犇犖犃条形码基因片段扩增利用ＩＴＳ２和狀犱犺Ｆ基因的通用引物进行ＩＴＳ２和狀犱犺Ｆ基因序列扩增，引物序列、反应体系和反应条件见附录Ｂ。７．４　犘犆犚产物的检测取ＰＣＲ产物５μＬ，１．５％琼脂糖凝胶电泳，核酸凝胶染料染色，在凝胶成像系统观察、拍照。ＩＴＳ２引物对可获得约４５０ｂｐ左右的扩增片段，狀犱犺Ｆ引物对可获得约７７０ｂｐ的扩增片段。２犛犖／犜４８７６．７—２０１９ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.７．５　测序与序列处理取剩余的ＰＣＲ扩增产物４５μＬ，经１．５％琼脂糖凝胶电泳分离，目的片段使用ＤＮＡ产物纯化试剂盒纯化并测序。测序引物与ＰＣＲ扩增引物相同。测序结果利用序列拼接软件进行拼接编辑，对比峰图，判断序列方向，去除测序引物序列，两端测序质量Ｑ值＜２０的序列去除。８　结果判定８．１　中国检疫性有害生物犇犖犃条形码鉴定系统判定登录中国检疫性有害生物ＤＮＡ条形码鉴定系统（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｂｏｌ．ｏｒｇ．ｃｎ），点击“物种识别 ”导航条，进入物种识别页面。在鉴定框内输入ＦＡＳＴＡ格式（或纯文本格式）序列后，点击“提交鉴定 ” ，系统进行ＢＬＡＳＴ后，自动生成鉴定结果（参见附录Ｃ）。当相似度最高的１０条序列为相同物种，最大相似度在９９％以上，ＩＴＳ２和狀犱犺Ｆ结果相符，且形态学鉴定与ＧＢ／Ｔ３２１４２一致，可判定为该物种；否则请辅以其他鉴定方法。８．２　植物有害生物检疫鉴定系统判定登陆植物有害生物检疫鉴定系统（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｏｔｉｃｏｒｇａｎｉｓｍ．ｃｏｍ），使用基因条码分析软件对查询序列进行分析比对，对符合该类群鉴定特征的且相似度为１００％的物种判定为该未知种。ＩＴＳ２和狀犱犺Ｆ结果相

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