SN-T 4849.5-2017 出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法实时荧光PCR法第5部分蔓越莓和蓝莓

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜４８４９．５—２０１７出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法　实时荧光犘犆犚法第５部分：蔓越莓和蓝莓犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲犻狀犵狉犲犱犻犲狀狋狊狅犳犮狅犿犿狅狀狊犿犪犾犾犫犲狉狉狔犳狉狌犻狋狊犻狀犳狅狅犱犪狀犱犼狌犻犮犲犳狅狉犲狓狆狅狉狋—犚犲犪犾  狋犻犿犲犘犆犚犿犲狋犺狅犱 —犘犪狉狋５：犆狉犪狀犫犲狉狉狔／犫犾狌犲犫犲狉狉狔２０１７０７２１发布２０１８０３０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　ＳＮ／Ｔ４８４９《出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法　实时荧光ＰＣＲ法》系列标准共分为６部分： — — —第１部分：蓝莓； — — —第２部分：树莓； — — —第３部分：黑加仑； — — —第４部分：桑葚； — — —第５部分：蔓越莓和蓝莓； — — —第６部分：猕猴桃。本部分为ＳＮ／Ｔ４８４９的第５部分。本部分按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院。本部分主要起草人：吴亚君、陈颖、杨艳歌、黄文胜、韩建勋、张九凯、邓婷婷、王斌、刘鸣畅。 Ⅰ犛犖／犜４８４９．５—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法　实时荧光犘犆犚法第５部分：蔓越莓和蓝莓１　范围ＳＮ／Ｔ４８４９的本部分规定了出口食品及饮料中蔓越莓和蓝莓成分的检测方法　实时荧光ＰＣＲ法。本部分适用于鲜果、冷冻果、蜜饯、鲜榨果汁、果肉型果汁、混浊汁、果干、果酱、及其他以蔓越莓和蓝莓为原辅料的食品及饮料中蔓越莓和蓝莓成分的定性检测（清汁及果酒除外）。本部分所规定方法的最低检出限（ＬＯＤ）为１％（体积比）。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ／Ｔ２７４０３ —２００８　实验室质量控制规范　食品分子生物学检测ＧＢ／Ｔ２７６５８ —２０１１　蓝莓３　术语、定义和缩略语３．１　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１．１小浆果　狊犿犪犾犾犫犲狉狉狔犳狉狌犻狋狊浆果是指由一个子房或联合其他花器发育成的柔软多汁的肉质单果，由一个或几个心皮形成。小浆果则泛指果实较小、多汁的一类浆果。３．１．２蔓越莓　犮狉犪狀犫犲狉狉狔杜鹃花科越橘属红莓苔子亚属，一种表皮及果肉都是鲜红色的圆形小浆果的俗称，别名：蔓越橘、小红莓，酸果蔓、蔓越梅、鹤莓。拉丁学名：犗狓狔犮狅犮犮狅狊。分为大果红莓苔子（美洲蔓越橘）（犞犪犮犮犻狀犻狌犿犿犪犮 狉狅犮犪狉狆狅狀），小果红莓苔子（毛蒿豆）（犞犪犮犮犻狀犻狌犿犿犻犮狉狅犮犪狉狆狌犿），红莓苔子（北方蔓越橘）（犞犪犮犮犻狀犻狌犿狅狓狔犮狅犮犮狌狊），红果扁枝越橘（南方蔓越橘）（犞犪犮犮犻狀犻狌犿犲狉狔狋犺狉狅犮犪狉狆狌犿）４个品种群。３．１．３蓝莓　犫犾狌犲犫犲狉狉狔根据ＧＢ／Ｔ２７６５８ —２０１１描述，蓝莓是杜鹃花科越橘属植物中蓝果类型的果实，小浆果，近圆形或圆扁形，并披一层白色果粉，果肉细腻，种子极小。拉丁学名：犞犪犮犮犻狀犻狌犿ｓｐｐ．，分为兔眼蓝莓（犞犪犮犮犻狀犻狌犿狏犻狉犵犪 狋狌犿）、高丛蓝莓（犞犪犮犮犻狀犻狌犿犮狅狉狔犿犫狅狊狌犿Ｌ．）（分：南高丛蓝莓、北高丛蓝莓）、半高丛蓝莓（犞犪犮犮犻狀犻狌犿犪狀犵狌狊狋 １犛犖／犜４８４９．５—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.犻犳狅犾犻狌犿×犞犪犮犮犻狀犻狌犿犮狅狉狔犿犫狅狊狌犿）、矮丛蓝莓（犞犪犮犮犻狀犻狌犿犪狀犵狌狊狋犻犳狅犾犻狌犿）五个品种群。３．２　缩略语下列缩略语适用于本文件。ＤＮＡ：脱氧核糖核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｌｅｉｃａｃｉｄ）。ＰＣＲ：聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）。Ｃｔ值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。ｄＮＴＰ：脱氧核苷酸三磷酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）。ｄＡＴＰ：脱氧腺苷三磷酸（ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）。ｄＣＴＰ：脱氧胞苷三磷酸（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）。ｄＧＴＰ：脱氧鸟苷三磷酸（ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）。ｄＴＴＰ：脱氧胸苷三磷酸（ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）。ＵＮＧ：尿嘧啶Ｎ 糖基化酶（ｕｒａｃｉｌＮ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）。ＣＴＡＢ：十六烷基三甲基溴化铵（ｃｅｔｙｌｔｒｉｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）。Ｔｒｉｓ：三羟甲基氨基甲烷［Ｔｒｉｓ（Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ］。ＥＤＴＡ：乙二胺四乙酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）。犜犪狇：水生栖热菌（犜犺犲狉犿狌狊犪狇狌犪狋犻犮狌狊）。ＯＤ：光度密度（ｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ）。４　方法提要果实样品直接粉碎离心，果汁样品直接离心，提取沉淀ＤＮＡ，果干、果酱、蜜饯先用蒸馏水清洗再提取ＤＮＡ。以蔓越莓或蓝莓果实为阳性对照，以其他水果ＤＮＡ为阴性对照，无菌水作为空白对照。使用特异性引物进行实时荧光ＰＣＲ扩增，通过实时荧光信号曲线判定是否存在蔓越莓或蓝莓成分。５　试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合ＧＢ／Ｔ６６８２的要求。所有试剂均用无ＤＮＡ酶污染的容器分装。５．１　检测用引物和探针：蔓越莓和蓝莓成分扩增引物和探针、内参照（显花植物ＮＡＤＨ基因）引物和探针详见表１。蔓越莓和蓝莓扩增靶标序列参见附录Ａ。表１　蔓越莓和蓝莓序列引物探针物种名称引物／探针序列（５ ′→３ ′）扩增片段长度靶基因内参照Ｆ：ＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＴＡＣＴＴＴＣＧＡＡＧＴＡＡＣＡＲ：ＡＧＧＡＧＣＣＧＴＧＴＧＡＧＡＴＧＡＡＡＧＴＣＴＣＡＰ：ＦＡＭ  ＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＴＣＡＧＡＧＴＣＧＡＡＡＡＧＡＧＧ  ＢＨＱ１１３８ｂｐＮＡＤＨｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓｕｂｕｎｉｔＢ（狀犱犺犅）ｇｅｎｅ蔓越莓和蓝莓Ｆ：ＣＡＴＴＴＴＡＧＣＴＴＣＡＡＡＴＧＧＴＴＣＧＴＣＴＲ：ＴＧＡＧＴＣＣＧＴＡＣＣＡＴＴＧＡＡＧＧＴＴＴＴＡＰ：ＦＡＭ  ＡＣＧＣＴＴＧＡＡＡＧＡＴＡＧＣＣＣＡＧＡＡＡＧＴＣＧＡＡ  ＴＡＭＡＲ１９２ｂｐｍａｔｕｒａｓｅＫ（犿犪狋犓）ｇｅｎｅ２犛犖／犜４８４９．５—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.５．２　三氯甲烷（氯仿）。５．３　异丙醇。５．４　ＣＴＡＢ提取缓冲液：２０ｇ／ＬＣＴＡＢ，１．４ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，０．１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ  ＨＣｌ，０．０２ｍｏｌ／ＬＮａ２ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０。５．５　ＣＴＡＢ沉淀液：５ｇ／ＬＣＴＡＢ，４０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ。５．６　７０％乙醇（体积分数）。５．

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