SN-T 4828-2017 韦塞尔斯布朗病抗体血凝抑制试验检测方法

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜４８２８—２０１７韦塞尔斯布朗病抗体血凝抑制试验检测方法犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犪狀狋犻犫狅犱犻犲狊犪犵犪犻狀狊狋犠犲狊狊犲犾狊犫狉狅犾犱犻狊犲犪狊犲狏犻狉狌狊犫狔犎犐２０１７０７２１发布２０１８０３０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：刘艳华、高志强、谷强、张伟、蒲静、乔彩霞、尹羿、汪琳、张利峰、凌凤俊。 Ⅰ犛犖／犜４８２８—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.韦塞尔斯布朗病抗体血凝抑制试验检测方法１　范围本标准规定了进出口动物韦塞尔斯布朗病抗体的血凝抑制试验检测方法。本标准适用于进出口动物韦塞尔斯布朗病抗体的检测。２　缩略语下列缩略语适用于本文件。ＰＢＳ：　　　　　　磷酸盐缓冲盐水ＨＡ：血凝试验ＨＩ：血凝抑制试验ＨＡＵ：血凝单位３　设备、材料和试剂３．１　设备３．１．１　台式离心机。３．１．２　振荡器。３．１．３　冰箱。３．１．４　恒温箱。３．１．５　微量可调移液器。３．２　材料和试剂３．２．１　９６孔Ｖ型微量反应板。３．２．２　含０．４％卵清蛋白的ｐＨ７．５ＰＢＳ和含０．４％卵清蛋白的ｐＨ５．７ＰＢＳ，配制方法见附录Ａ。３．２．３　阿氏（Ａｌｓｅｖｅｒｓ）液，配制方法见附录Ｂ的Ｂ．１。３．２．４　０．５％鹅红细胞悬液，配制方法见Ｂ．２。３．２．５　韦塞尔斯布朗病血凝抗原，阳性血清和阴性血清。３．３　被检血清无菌采集动物血液，凝固后离心分离血清，５６℃灭活处理３０ｍｉｎ后，置于４℃或－２０℃保存备用。被检血清须采用高岭土 鹅红细胞吸附法去除非特异性凝集素。按如下方法进行处理：０．１ｍＬ被检血清，加入０．４ｍＬｐＨ７．５磷酸盐缓冲液，再加入０．５ｍＬ２５％高岭土，充分振荡混合，室温作用２０ｍｉｎ，然后１０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ取上清，加入２５μＬ０．５％鹅红细胞悬液，轻轻振荡，冰浴吸附２０ｍｉｎ，１０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，吸取上清，即为１∶１０稀释的被检血清。１犛犖／犜４８２８—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.４　操作步骤４．１　血凝试验（见表１）４．１．１　在微量反应板的每孔均加入２５μＬ含０．４％卵清蛋白的ｐＨ７．５ＰＢＳ。４．１．２　吸取２５μＬ韦塞尔斯布朗病血凝抗原加入第１孔，反复吹打混匀。４．１．３　从第１孔吸取２５μＬ液体加入第２孔，混匀后吸取２５μＬ液体加入第３孔，如此对倍稀释至第１１孔，第１１孔混匀后吸弃２５μＬ。４．１．４　每孔加入２５μＬ含０．４％卵清蛋白的ｐＨ５．７ＰＢＳ。４．１．５　每孔加入５０μＬ０．５％鹅红细胞悬液（加之前，红细胞悬液要充分摇匀）。４．１．６　轻轻振荡混匀，在２０℃～２５℃下静置６０ｍｉｎ后观察结果。４．１．７　血凝效价确定：对照孔（第１２孔）红细胞应呈现明显的纽扣状沉淀于孔底。将板倾斜，观察红细胞有无呈泪珠状流淌，完全血凝（不流淌）的抗原最高稀释倍数为该抗原的血凝效价，代表１个血凝单位（ＨＡＵ）。４．１．８　根据４．１．７的结果，使用含０．４％卵清蛋白的ｐＨ７．５ＰＢＳ配制４ＨＡＵ的病毒抗原，以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以４即为４ＨＡＵ抗原的稀释倍数。例如表２抗原效价为２４（１∶１６），４ＨＡＵ抗原的稀释倍数为２２（１∶４）。４．１．９　将２５μＬ含４个血凝单位的抗原用ＰＢＳ做等量倍比稀释，使每孔（２５μＬ）含有２ＨＡＵ、１ＨＡＵ、０．５ＨＡＵ和０．２５ＨＡＵ，每孔补加２５μＬＰＢＳ，再加入５０μＬ０．５％鹅红细胞悬液，判定血凝结果与预期结果是否相符合。２ＨＡＵ、１ＨＡＵ孔红细胞应出现完全凝集，０．５ＨＡＵ孔红细胞应出现５０％凝集，０．２５ＨＡＵ孔红细胞应不凝集。若不相符，应重新配制抗原，测定效价。表１　血凝试验４．２　血凝抑制试验（见表２）４．２．１　在微量反应板的每孔均加入２５μＬ含０．４％卵清蛋白的ｐＨ５．７ＰＢＳ。４．２．２　吸取２５μＬ已经处理１∶１０稀释的被检血清加入第１孔内，充分混匀后吸取２５μＬ于第２孔内，如此对倍稀释至第１０孔，混匀后吸弃２５μＬ。最后２孔不加血清，分别作抗原对照和空白对照。４．２．３　除空白对照孔外，每孔加入４ＨＡＵ的抗原２５μＬ，空白对照孔加入２５μＬ含０．４％卵清蛋白的ｐＨ５．７ＰＢＳ，在２０℃～２５℃下静置６０ｍｉｎ。４．２．４　每孔加入５０μＬ０．５％鹅红细胞悬液（加之前，红细胞悬液要充分摇匀）。２犛犖／犜４８２８—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.４．２．５　轻轻振荡混匀，在２０℃～２５℃下静置６０ｍｉｎ后观察结果。４．２．６　每次测定应设阳性血清和阴性血清对照，按被检血清进行系列稀释测定。表２　血凝抑制试验５　结果判定５．１　判定时首先观察对照孔是否成立。５．２　红细胞凝集：红细胞均匀分散在孔底周围，将板倾斜，红细胞不流淌判为完全凝集，判定为血凝作用阳性，记作“＋” 。５．３　无凝集：红细胞集中在孔底中央呈圆点、倾斜血凝板时呈泪珠状流淌，判定为不凝集或血凝抑制，记作“－” 。５．４　血凝抑制价：以能使４个ＨＡＵ抗原凝集红细胞作用完全被抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的血凝抑制价（如表２的血凝抑制价为１∶１６０）。５．５　血凝抑制价大于或等于１／４０为阳性，血凝抑制价等于１／２０为可疑，需重复试验，重复试验结果仍为１／２０，判为阳性。３犛犖／犜４８２８—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.附　录　犃（规范性附录）含０．４％卵清蛋白犘犅犛配制犃．１　犃液０．２ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钠水溶液：ＮａＨ２ＰＯ４·Ｈ２Ｏ２７．６ｇ，溶于蒸馏水中，最后稀释至１０００ｍＬ。犃．２　犅液０．２ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二钠水溶液：Ｎａ２ＨＰＯ４·７Ｈ２Ｏ５３．６ｇ（或Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ７１．６ｇ或Ｎａ２ＨＰＯ４·２Ｈ２Ｏ３５．６ｇ），加蒸馏水溶解，最后稀释至１０００ｍＬ。犃．３　含０．４％卵清蛋白狆犎７．５犘犅犛的配制０．２ｍｏｌ／ＬＡ液８ｍＬ０．２ｍｏｌ／ＬＢ液４２ｍＬ氯化钠８．５ｇ４ｇ卵清蛋白用蒸馏水定容至１０００ｍＬ，过滤除菌后２℃～８℃冰箱保存。犃．４　含０．４％卵清蛋白狆犎５．７犘犅犛的配制０．２ｍｏｌ／ＬＡ液４６．７５ｍＬ０．２ｍｏｌ／ＬＢ液３．２５ｍＬ氯化钠８．５ｇ４ｇ卵清蛋白用蒸馏水定容至１０００ｍＬ，过滤除菌后２℃～８℃冰箱保存。４犛犖／犜４８２８—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.附　录　犅（规范性附录）阿氏（犃犾狊犲狏犲狉狊）液、０．５％鹅红细胞悬液配制犅．１　阿氏（犃犾狊犲狏犲狉狊）液配制葡萄糖　２０．５ｇ二水合柠檬酸钠　８．０ｇ柠檬酸　０．５５ｇＮａＣｌ　４．２ｇ溶于蒸馏水，并稀释至１０００ｍＬ，用１ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ或１ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ调节至ｐＨ＝６．１，用孔径为０．２２μｍ的滤膜进行过滤除菌。犅．２　０．５％鹅红细胞悬液制备采集鹅血液与等体积阿氏液混合摇匀，用５倍量生理盐水洗涤３次，每次均以１０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，直至上清透明无色。配制红细胞悬液时，再用含０．４％卵清蛋白ｐＨ５．７ＰＢＳ洗涤１次，以１０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取沉淀红细胞用含０．４％卵清蛋白ｐＨ５．７ＰＢＳ配成体积分数为０．５％鹅红细胞悬液，４℃保存备用。５犛犖／犜４８２８—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.