SN-T 4793-2017 国境口岸疟原虫实时荧光PCR检测方法

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜４７９３—２０１７国境口岸疟原虫实时荧光犘犆犚检测方法犜犲狊狋犿犲狋犺狅犱狊犳狅狉犘犾犪狊犿狅犱犻狌犿犫狔狉犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚犪狋狆狅狉狋狊２０１７０５１２发布２０１７１２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国汕头出入境检验检疫局、中华人民共和国广州机场出入境检验检疫局。本标准主要起草人：师永霞、李小波、朱俊贤、李燕、黄吉城、幸芦琴、洪烨、孙薇、钟玉清、相大鹏。 Ⅰ犛犖／犜４７９３—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.国境口岸疟原虫实时荧光犘犆犚检测方法１　范围本标准规定了国境口岸疟疾检测的生物安全要求，标本的采集、运输和保存，疟疾实时荧光ＰＣＲ检测方法。本标准适用于国境口岸入出境疑似恶性疟、间日疟、卵形疟和三日疟感染对象的实时荧光ＰＣＲ检测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求人间传染的病原微生物名录（卫科教发〔２００６〕１５号）３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１疟疾　犿犪犾犪狉犻犪由人类疟原虫感染引起的寄生虫病，主要由雌性按蚊叮咬传播。疟原虫先侵入肝细胞发育繁殖，再侵入红细胞繁殖，引起红细胞成批破裂而发病。临床上以反复发作的间歇性寒战、高热、继之出大汗后缓解为特点。３．２疟原虫　犘犾犪狊犿狅犱犻狌犿属于真球虫目（Ｅｕｃｏｃｃｉｄｉｉｄａ）、疟原虫科（Ｐｌａｓｍｏｄｉｄａｅ）、疟原虫属（犘犾犪狊犿狅犱犻狌犿），是疟疾的病原体。寄生于人类的疟原虫有４种，即间日疟原虫（犘犾犪狊犿狅犱犻狌犿狏犻狏犪狓）、恶性疟原虫（犘犾犪狊犿狅犱犻狌犿犳犪犾犮犻  狆犪狉狌犿）、三日疟原虫（犘犾犪狊犿狅犱犻狌犿犿犪犾犪狉犻犪犲）及卵形疟原虫（犘犾犪狊犿狅犱犻狌犿狅狏犪犾犲），分别引起间日疟、恶性疟、三日疟和卵形疟。４　缩略语下列缩略语适用于本文件。实时荧光ＲＴ  ＰＣＲ：实时荧光反转录 聚合酶链反应。Ｃｔ值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。ＤＮＡ：脱氧核糖核酸。ＦＡＭ：ＦＡＭ荧光染料，一种荧光报告基团。１犛犖／犜４７９３—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.５　生物安全要求疟原虫相关材料的实验活动按照ＧＢ１９４８９和《人间传染的病原微生物名录》中的生物安全要求进行。６　人抗凝血清标本的采集、运输和保存无菌采集疑似病例静脉血３ｍＬ～５ｍＬ至２％ＥＤＴＡ  Ｎａ２抗凝管，用耐低温油性记号笔记上编号，低温冷链送到实验室检测。如２４ｈ内不能送到实验室，－２０℃低温保存。实验室接到样本后，应尽快进行检测，并避免反复冻融。７　主要仪器本方法使用的主要仪器包括： — — —荧光定量ＰＣＲ仪； — — —超净工作台； — — —ＩＩＡ级生物安全柜； — — —高压灭菌锅； — — —低温高速离心机（最大离心力２００００× 犵）； — — —漩涡振荡器； — — —冰箱（４℃、－２０℃和－７０℃）； — — —移液器等。８　主要试剂本方法使用的主要试剂包括核酸提取试剂，如Ｑｉａｇｅｎ公司的ＱＩＡａｍｐＤＮＡＢｌｏｏｄＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＭｉｎｉｋｉｔ提取疟原虫核酸１）、实时荧光ＰＣＲ通用试剂如中国ＣＹｂｉｏ公司的ＨＲＱｐｃｒＭａｓｔｅｒＭｉｘ２）、染料掺入法荧光ＰＣＲ试剂如Ｑｉａｇｅｎ公司的ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲＫｉｔ３）、无ＤＮＡ酶的双蒸水、引物和探针等，引物和探针序列见表１。表１　疟原虫实时荧光犘犆犚检测的引物和探针引物／探针名称序列（５’ ３’ ）备注Ｐｌａｓ  ＦＰＡＧＴＴＡＡＧＧＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡＴＣＡＧＡＰｌａｓ  ＲＰＴＣＡＴＣＣＡＡＭＲＣＣＴＡＧＴＣＧＧＣＡＴＡＧＴＴＴＡＴＰｌａｓ  ＰｒｏＦＡＭ  ＡＣＣＧＴＣＧＴＡＡＴＣＴＴ  ＭＧＢ疟原虫通用ＰＦ  ＦＰＣＴＴＴＴＧＡＧＡＧＧＴＴＴＴＧＴＴＡＣＴＴＴＧＡＧＴＡＡＰＦ  ＲＰＴＡＴＴＣＣＡＴＧＣＴＧＴＡＧＴＡＴＴＣＡＡＡＣＡＣＡＡＰＦ  ＰｒｏＦＡＭ  ＴＧＴＴＣＡＴＡＡＣＡＧＡＣＧＧＧＴＡＧＴＣＡＴＧＡＴＴＧＡＧＴＴＣＡ  ＢＨＱ１恶性疟１），２），３）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。２犛犖／犜４７９３—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.表１（续）引物／探针名称序列（５’ ３’ ）备注ＰＶ  ＦＰＡＣＧＣＴＴＣＴＡＧＣＴＴＡＡＴＣＣＡＣＡＴＡＡＣＴＰＶ  ＲＰＡＣＴＴＣＣＡＡＧＣＣＲＡＡＧＣＡＡＡＧＡＡＡＧＴＣＣＰＶ  ＰｒｏＦＡＭ  ＴＴＣＧＴＡＴＣＧＡＣＴＴＴＧＴＧＣＧＣＡＴＴＴＴＧＣ  ＢＨＱ１间日疟ＰＯ  ＦＰＡＴＴＡＡＴＧＴＧＴＣＣＴＴＴＴＣＣＣＴＡＴＴＣＴＰＯ  ＲＰＧＣＴＴＴＡＣＡＡＴＣＡＡＡＣＧＡＡＴＡＣＡＴＴＣ卵形疟，熔解曲线犜ｍ值为７２．５℃ ＰＭ  ＦＰＣＣＧＡＣＴＡＧＧＴＧＴＴＧＧＡＴＧＡＴＡＧＡＧＴＡＡＡＰＭ  ＲＰＡＡＣＣＣＡＡＡＧＡＣＴＴＴＧＡＴＴＴＣＴＣＡＴＡＡＰＭ  ＰｒｏＦＡＭ  ＣＴＡＴＣＴＡＡＡＡＧＡＡＡＣＡＣＴＣＡＴ  ＭＧＢ三日疟９　疟疾的实时荧光犘犆犚检测９．１　核酸提取按试剂盒说明提取核酸，用于实时荧光ＰＣＲ检测或－２０℃储存ＤＮＡ待检。９．２　疟原虫通用实时荧光犘犆犚检测９．２．１　加样制备实时荧光ＰＣＲ反应液，反应体系为２５μＬ（见表２）。每个反应体系均设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板为根据疟原虫上下游引物间的核苷酸序列合成的ＤＮＡ片段，阴性对照模板为不含疟原虫核酸的标本或无ＤＮＡ酶的水。表２　疟原虫实时荧光犘犆犚反应体系反应成分体积／μＬ２×ＭａｓｔｅｒＭｉｘ１２．５１０μｍｏｌ／Ｌ正向引物１．２５１０μｍｏｌ／Ｌ反向引物１．２５５μｍｏｌ／Ｌ探针１．２５无ＤＮＡ酶的双蒸水３．７５待测样本ＤＮＡ５９．２．２　实时荧光犘犆犚扩增反应在不同的荧光定量ＰＣＲ仪上，ＴａｑＭａｎ探针实时荧光ＰＣＲ的反应条件略有不同。以ＡＢＩ７５００ＨＴ荧光定量ＰＣＲ仪为例，实时荧光ＰＣＲ检测扩增程序为：９５℃５ｍｉｎ；９５℃１０ｓ，５８℃４５ｓ，４０个循环，在５８℃收集荧光。如使用其他仪器，应根据其他仪器的要求进行适当调整。３犛犖／犜４７９３—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.９．３　疟原虫种特异性实时荧光犘犆犚检测９．３．１　加样采用荧光探针法进行恶性疟、间日疟和三日疟的实时荧光ＰＣＲ检测，分别在３个离心管中配制恶性疟、间日疟和三日疟的反应液，反应体系为２５μＬ（见表２）。采用染料掺入法进行卵形疟的实时荧光ＰＣＲ检测，反应体系为２５μＬ（见表３）。每个反应体系均设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板分别为根据恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫上下游引物间的核苷酸序列合成的ＤＮＡ片段，阴性对照模板为不含疟原虫核酸的标本或无ＤＮＡ酶的水。表３　卵形疟原虫实时荧光犘犆犚反应体系反应成分体积／μＬ２×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ１２．５１０μｍｏｌ／Ｌ正向引