书书书　 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜４ ７ ７ ８—２ ０ １ ７ 出口花粉中链霉素和双氢链霉素的测定方法液相色谱 质谱／质谱法 犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳狊 狋 狉 犲 狆狋 狅 犿狔犮 犻 狀犪 狀 犱犱 犻 犺 狔犱 狉 狅 狊 狋 狉 犲狆狋 狅 犿狔犮 犻 狀犻 狀狆狅 犾 犾 犲 狀犳 狅 狉犲 狓 狆狅 狉 狋—犔 犆  犕 犛／犕 犛犿 犲 狋 犺 狅 犱 ２ ０ １ ７０ ５１ ２发布 ２ ０ １ ７１ ２０ １实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　本标准按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 。本标准起草单位 ：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局 。本标准主要起草人 ：黄娟、刘艳、柳菡、李静静、姜珊、陈惠兰、殷耀、张晓燕、丁涛。 Ⅰ犛 犖／犜４ ７ ７ ８—２ ０ １ ７ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.出口花粉中链霉素和双氢链霉素的测定方法液相色谱 质谱／质谱法 １　范围 本标准规定了出口花粉中链霉素和双氢链霉素的液相色谱 质谱／质谱法测定方法 。本标准适用于出口松花粉 、玉米花粉 、茶花粉、葵花粉、油菜花粉和杂花粉等中链霉素和双氢链霉素的测定和确证 。 ２　规范性文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２　分析实验室用水规格和试验方法 ３　方法提要 样品中的链霉素和双氢链霉素经提取溶液提取 ，三氯甲烷沉淀样品中的蛋白质 ，清液过Ｃ１ ８小柱净 化后用液相色谱 质谱／质谱法测定 。外标法定量 。 ４　试剂和材料 除非另有说明 ，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂 ，水采用Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２中规定的一级水 。 ４．１　甲醇：高效液相色谱级 。 ４．２　磷酸。 ４．３　叔丁基甲基醚 。 ４．４　甲酸：高效液相色谱级 。 ４．５　正己烷。 ４．６　三氯甲烷 。 ４．７　乙酸铵：ＣＨ３ＣＯ２ＮＨ４，高效液相色谱级 。 ４．８　庚烷磺酸钠 （Ｃ７Ｈ１ ５Ｓ Ｏ３Ｎ ａ） 。 ４．９　磷酸钠［Ｎ ａ３ＰＯ４·（Ｈ２Ｏ）１ ２］ 。 ４．１ ０　提取溶液 ：准确称取 １ ０． １ｇ庚烷磺酸钠 （４． ８） ，４． １ｇ磷酸钠（４． ９） ，用水溶解并转移至 １０ ０ ０ｍＬ 容量瓶中，加５ｍＬ磷酸（４． ２） ，用水定容至刻度 。 ４．１ １　叔丁基甲基醚 正己烷溶液 （４＋１，体积比） ：准确量取 ４ ０ ０ｍＬ 叔丁基甲基醚 （４． ３） ，加入１ ０ ０ｍＬ正己烷（４． ５） ，混合均匀 。 ４．１ ２　甲酸溶液 （５‰，体积比） ：准确量取 ５ｍＬ甲酸（４． ４） ，加入至１０ ０ ０ｍＬ 容量瓶中 ，用水定容至刻度。 ４．１ ３　０． ０ ２ｍ ｏ ｌ ／Ｌ乙酸铵溶液 ：准确称取 １． ５ ４ｇ乙酸铵（４． ７） ，用水溶解并转移至 １０ ０ ０ｍＬ 容量瓶中 ，用水定容至刻度 。 １犛 犖／犜４ ７ ７ ８—２ ０ １ ７ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.４．１ ４　甲醇水溶液 （３＋７，体积比） ：准确量取 ３ ０ ０ｍＬ 甲醇，加入７ ０ ０ｍＬ 水，混合均匀 。 ４．１ ５　链霉素标准品 ［Ｓ ｔ ｒ ｅｐｔ ｏ ｍｙｃ ｉ ｎＳ ｕ ｌ ｆ ａ ｔ ｅ ， （Ｃ２ １Ｈ３ ９Ｎ７Ｏ１ ２）２·（Ｈ２Ｓ Ｏ４）３，ＣＡ ＳＮ ｏ ：３ ８ １ ０  ７ ４  ０ ］纯度大于或等于 ９ ８％。 ４．１ ６　双氢链霉素标准品 ［Ｄ ｉ ｈｙｄ ｒ ｏ ｓ ｔ ｒ ｅｐｔ ｏ ｍｙｃ ｉ ｎＳ ｅ ｓｑｕ ｉ ｓ ｕ ｌ ｆ ａ ｔ ｅＨ ｙｄ ｒ ａ ｔ ｅ，（Ｃ２ １Ｈ４ １Ｎ７Ｏ１ ２）２·（Ｈ２Ｓ Ｏ４）３， Ｃ Ａ ＳＮ ｏ ：５ ４ ９ ０  ２ ７  ７ ］纯度大于或等于 ９ ９％。 ４．１ ７　标准储备液 ：分别准确称取适量的链霉素 、双氢链霉素标准品 ，用甲醇水溶液 （４． １ ４）配制成浓度为１ｍｇ／ｍＬ的标准储备溶液 。０℃～４℃保存。 ４．１ ８　混合标准中间溶液 ：分别准确移取一定体积的链霉素 、双氢链霉素标准储备液 （４． １ ７） ，用甲醇水溶液（４． １ ４）稀释为１ ０μｇ／ｍＬ，０℃～４℃保存。 ４．１ ９　混合标准工作液 ：准确移取一定体积的混合标准中间溶液 （４． １ ８） ，用甲醇水溶液 （４． １ ４）稀释成 １． ０μｇ／ｍＬ，现用现配 。 ４．２ ０　Ｃ１ ８小柱：５ ０ ０ｍｇ，３ｍＬ，或相当者 。 ４．２ １　微孔滤膜 ：水相，０． ４ ５μｍ。 ５　仪器和设备 ５．１　液相色谱 串联质谱仪 ：配有电喷雾离子源 （Ｅ Ｓ Ｉ） 。 ５．２　分析天平 ：感量分别为 ０． ０ １ｇ和０． ０ １ｍｇ。 ５．３　高速离心机 ：８０ ０ ０ｒ／ｍ ｉ ｎ。 ５．４　超声振荡器 。 ５．５　涡旋混合器 。 ５．６　氮吹仪。 ５．７　具塞塑料离心管 ：５ ０ｍＬ。 ５．８　Ｓ Ｐ Ｅ固相萃取装置 。 ６　试样制备和保存 取有代表性的样品约 ５ ０ ０ｇ，用磨碎机全部磨碎并通过 ２ ０目筛，混匀，均分成两份作为试样 ，分别装入洁净的容器内 ，密封，标明标记 ，于常温下保存 。在制样的操作过程中 ，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化 。 ７　分析步骤 ７．１　样品处理 ７．１．１　提取 称取２ｇ试样（精确到０． ０ １ｇ）置于５ ０ｍＬ具塞塑料离心管中 ，加入提取溶液 （４． １ ０）２ ０ｍＬ，三氯甲烷３ｍＬ，于涡旋混匀器上混合 ３ｍ ｉ ｎ，混合均匀后置于超声振荡器中超声 １ ５ｍ ｉ ｎ，８０ ０ ０ｒ／ｍ ｉ ｎ高速离心５ｍ ｉ ｎ。取上层清液收集于塑料离心管中 ，供净化用 。 ７．１．２　净化 将Ｃ１ ８小柱（预先用５ｍＬ甲醇，５ｍＬ水活化）连接于２ ０ｍＬ塑料针筒下 ，将样液以 １滴／ｓ～２滴／ｓ的流速全部通过 Ｃ１ ８小柱，在样液在小柱上还剩约 ２ｍＬ左右时，加入５ｍＬ水以１滴／ｓ～２滴／ｓ的流速 ２犛 犖／犜４ ７ ７ ８—２ ０ １ ７ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.淋洗小柱 ，直至空气流经小柱 ，弃去流出液 。去除针筒 ，加压抽干约 ３ｍ ｉ ｎ后加３ｍＬ叔丁基甲基醚 正己烷溶液 （４． １ １）以１滴／ｓ～２滴／ｓ的流速淋洗小柱 ，弃去流出液 ，加压抽干约 ５ｍ ｉ ｎ后加入５ｍＬ甲醇以１滴／ｓ的流速洗脱于 １ ０ｍＬ试管中。该洗脱液于 ４ ５℃下氮气吹干 ，加入０． ０ ２ｍ ｏ ｌ ／Ｌ乙酸铵溶液 １． ０ｍＬ 溶解残渣 ，充分涡旋混合后过 ０． ４ ５μｍ水相滤膜 （４． ２ １） ，供液相色谱 质谱／质谱仪测定 。 ７．１．３　基质标准溶液的制备 称取５份约２ｇ阴性试样 （精确至０． ０ １ｇ）置于５ ０ｍＬ具塞塑料离心管中 ，分别加入标准品工作液 （４． １ ９）１ ０μＬ、２ ０μＬ、５ ０μＬ、１ ０ ０μＬ、２ ０ ０μＬ，余下操作同 ７． １． １～７． １． ２。 ７．２　测定 ７．２．１　液相色谱条件 液相色谱条件如下 ： ａ）　色谱柱：Ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｍ ｉ ｘＷＣ Ｘ  Ｎ Ｐ ５ 柱，２． １ｍｍ×１ ０ ０ｍｍ ，５μｍ或相当者 ； ｂ）　流动相：５‰甲酸溶液 （４． １ ２） 、０． ０ ２ｍ ｏ ｌ ／Ｌ乙酸铵溶液 （４． １ ３）和甲醇，梯度洗脱 ；梯度参见附录 Ａ中表Ａ． １； ｃ）　流速：３ ５ ０μＬ／ｍ ｉ ｎ； ｄ）　进样量：２ ５μＬ； ｅ）　柱温：３ ５℃。 ７．２．２　质谱条件 质谱条件如下 ： ａ）　离子化模式 ：电喷雾正离子模式 （Ｅ Ｓ Ｉ ＋） ； ｂ）　质谱扫描方式 ：多反应监测 （ＭＲＭ） ； ｃ）　其他参考质谱条件参见附录 Ｂ中的表Ｂ． １。 ７．２．３　液相色谱 质谱／质谱测定 ７．２．３．１　定性测定 在上述色谱 质谱条件下 ，如果样品中检测的色谱峰保留时间与相应的标准品相差在 ±２． ５％以内，并且在扣除背景后所选择的两对离子对与浓度相当标准溶液的相对丰度一致 ，其相对丰度允许偏差不超过表１规定的范围 ，则可判定样品中存在对应的待测物 。 表１　定性确证时相对离子丰度的最大允许误差 相对离子丰度 （％基峰） ＞５ ０％ ＞２ ０％～５ ０％ ＞１ ０％～２ ０％ ≤１ ０％ 允许的相对误差 ±２ ０％ ±２ ５％ ±３ ０％ ±５ ０％ ７．２．３．２　定量测定 采用基质提取标准曲线测定样液中的被测物的含量 。样品中被测物量应在标准曲线范围之内 ，如果含量超出标准曲线范围 ，应适当稀释至标准曲线范围之内进行检测 。标准溶液的多反应监测 （ＭＲＭ）色谱图参见附录 Ｃ中的图Ｃ． １。 ３犛 犖／犜４ ７ ７ ８—２ ０ １ ７ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.７．３　空白试验 除不称取试样外 ，均按上述步骤进行 。 ８　结果计算和表述 采用外标法定量 ，用色谱数据处理机或按式 （１）计算样品中待测物残留量