SN-T 4748-2017 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎检疫技术规范

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜４７４８—２０１７淋巴细胞性脉络丛脑膜炎检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犾狔犿狆犺狅犮狔狋犻犮犮犺狅狉犻狅犿犲狀犻狀犵犻狋犻狊２０１７０５１２发布２０１７１２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国江西出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：张强、王艳、杨春华、熊炜、林颖峥、李树清、王巧全、朱事康、李健。 Ⅰ犛犖／犜４７４８—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.淋巴细胞性脉络丛脑膜炎检疫技术规范１　范围本标准规定了淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒荧光ＲＴ  ＰＣＲ和血清抗体酶联免疫吸附试验的技术规范。本标准适用于大鼠、小鼠、豚鼠和地鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎的诊断及流行病学调查。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求３　缩略语下列缩略语适用于本文件。ＢＳＡ：血清白蛋白（Ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ）ＥＬＩＳＡ：酶联免疫吸附试验（Ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）ＨＲＰ：辣根过氧化物酶（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）ＬＣＭＶ：淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓｖｉｒｕｓ）４　初步诊断参照附录Ａ疫病概述中的临床症状和流行病学资料可作出初步诊断，进一步应采集样品进行实验室检测。涉及到病原的检测应在二级生物安全实验室进行，样品保存和废弃物处理应按照ＧＢ１９４８９要求进行。５　实验室诊断５．１　荧光定量犚犜  犘犆犚试验５．１．１　试剂５．１．１．１　ＴＲＩＺＯＬ。５．１．１．２　三氯甲烷。５．１．１．３　异丙醇：－２０℃预冷。５．１．１．４　０．１％ＤＥＰＣ水。５．１．１．５　７５％乙醇。５．１．１．６　ＲＮＡ酶抑制剂（４０Ｕ／μＬ）。１犛犖／犜４７４８—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.５．１．１．７　ＴａｑＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／μＬ）及相应１０×缓冲液。５．１．１．８　Ｍ  ＭＬＶ反转录酶（２００Ｕ／μＬ）及相应５×反转录反应缓冲液。５．１．１．９　ｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）。５．１．１．１０　ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）５．１．２　设备５．１．２．１　二级生物安全柜。５．１．２．２　高压灭菌锅。５．１．２．３　微量移液器。５．１．２．４　高速冷冻离心机。５．１．２．５　荧光ＰＣＲ仪。５．１．３　引物和探针引物和探针针对ＬＣＭＶ基因组ＮＰ片段序列设计，由生物公司合成，纯度为ＨＰＬＣ级，用ＤＥＰＣ溶解至１０μｍｏｌ／Ｌ后，保存于－２０℃备用。引物、探针的名称、序列及位置见附录Ｂ的表Ｂ．１。５．１．４　质控物质５．１．４．１　阳性对照将ＬＣＭＶ基因ＮＰ片段克隆入质粒载体，提取质粒，并将其线性化，线性化时保证ＮＰ片段完整，经体外转录后制备成ｃＲＮＡ溶液，用做阳性对照。５．１．４．２　阴性对照ＬＣＭＶ阴性小鼠组织，经匀浆后，１０００犵离心５ｍｉｎ，取上清用做阴性对照。５．１．５　样品的采集制备处死受检动物，采集脑、脏器组织作为检测样本。采样过程中样品不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。用无菌剪刀和镊子剪取待检样品于研磨器中充分研磨，再加入５倍体积的ＰＢＳ混匀，然后将组织悬液转入无菌Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，编号备用。５．１．６　存放与运送采集或处理的样品在２℃～８℃条件下保存不超过２４ｈ；若需长期保存，应放置－７０℃冰箱，但应避免反复冻融（最多冻融３次）。５．１．７　样品核酸的提取５．１．７．１　取狀个１．５ｍＬ灭菌Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管，其中狀为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。５．１．７．２　每管加入６００μＬ裂解液，然后分别加入待测样品、阴性对照和阳性对照各２００μＬ，一份样品换用一个吸头；再加入２００μＬ三氯甲烷，混匀器上震荡混匀５ｓ。于４℃条件下，１２０００犵离心１５ｍｉｎ。５．１．７．３　取与５．１．７．１中相同数量的１．５ｍＬ灭菌Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管，加入５００μＬ异丙醇（－２０℃预冷），对每个管进行编号。吸取５．１．７．２离心后各管中的上清液转移至相应的管中，上清液至少吸取５００μＬ，注意不要吸出中间层，颠倒混匀。２犛犖／犜４７４８—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.５．１．７．４　于４℃条件下，１２０００犵离心１５ｍｉｎ。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。加入６００μＬ７５％乙醇，颠倒洗涤。５．１．７．５　于４℃条件下，１２０００犵离心１０ｍｉｎ。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。５．１．７．６　４０００犵离心１０ｓ，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样品换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥３ｍｉｎ。不宜过于干燥，以免ＲＮＡ不溶。５．１．７．７　加入１１μＬＤＥＰＣ水，轻轻混匀，溶解管壁上的ＲＮＡ，２０００犵离心５ｓ，冰上保存备用。提取的ＲＮＡ须在２ｈ内进行ＲＴ  ＰＣＲ扩增或放置于－７０℃冰箱，将核酸转移至反应混合物配制区。也可采用其他等效的商业化试剂盒提取核酸。５．１．８　扩增试剂准备与配制本步骤在反应混合物配制区进行。每个测试反应体系需使用１５μＬ荧光ＲＴ  ＰＣＲ反应液，反应液配方见表Ｂ．２。根据５．１．７．１中所设定的狀值，计算各试剂的使用量，加入适当体积试管中，充分混合均匀后，向每个ＰＣＲ管中各分装１５μＬ，转移至样品处理区。５．１．９　加样在样品处理区进行。在５．１．８的ＰＣＲ管中分别加入制备好的ＲＮＡ溶液１０μＬ，使总体积达２５μＬ。盖紧管盖后，５００犵离心３０ｓ。５．１．１０　荧光犚犜  犘犆犚反应在检测区进行。将５．１．９中加样后的ＰＣＲ管放入荧光ＰＣＲ检测仪内，记录样品摆放顺序，选定ＦＡＭ检测通道读取检测结果，选择ＴＡＭＲＡ作为淬灭基团。设置如下反应参数： — — —第一阶段，反转录４２℃／３０ｍｉｎ； — — —第二阶段，预变性９５℃／５ｍｉｎ； — — —第三阶段，９５℃／１５ｓ，５８℃／１ｍｉｎ，４０个循环，荧光收集设置在第三阶段每次循环的退火延伸时进行。５．１．１１　结果判定５．１．１１．１　质控标准阴性对照无Ｃｔ值并且无特定扩增曲线。阳性对照的Ｃｔ应≤３０，并出现特定的扩增曲线。如阴性对照和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。５．１．１１．２　结果描述及判定阴性：无Ｃｔ值并且无扩增曲线，表明样品中无ＬＣＭＶ核酸。阳性：Ｃｔ≤３５，且出现特定的扩增曲线，表示样品中存在ＬＣＭＶ核酸。可疑：３５＜Ｃｔ≤４０，判为可疑；可疑样品须重做，重做结果无Ｃｔ值者为阴性，否则为阳性。５．２　酶联免疫吸附试验（犈犔犐犛犃）５．２．１　试剂５．２．１．１　ＥＬＩＳＡ抗原：在生物安全实验室，用ＬＣＭＶ感染Ｖｅｒｏ细胞，当病变达８０％时，收获培养物。３犛犖／犜４７４８—２０１７ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.反复冻融三次或超声波处理后，２０００犵离心１０ｍｉｎ去除细胞碎片，上清液经超速离心浓缩后制成ＥＬＩＳＡ抗原；或用基因工程表达纯化ＬＣＭＶ抗原作为ＥＬＩＳＡ抗原。也可购买商品化抗原。５．２．１．２　ＥＬＩＳＡ对照抗原：未染