ICS 65.150 B 50 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 9435—2019 水产养殖环境（水体、底泥）中孔雀石绿 的测定 高效液相色谱法 Determination of malachite green in water and sediment from the aquaculture environment-High performance liquid chromatography 2019-08-01发布 2019-11-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 SC/T 9435—2019 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部渔业渔政管理局提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会渔业资源分技术委员会（SAC/TC156/SC10)归口。 本标准起草单位：中国水产科学研究院南海水产研究所。 本标准主要起草人：邓建朝、李来好、岑剑伟、杨贤庆、魏涯、杨少玲。 I SC/T9435—2019 水产养殖环境（水体、底泥)中孔雀石绿的 测定 高效液相色谱法 1范围 本标准规定了水产养殖环境(水体、底泥)中孔雀石绿的高效液相色谱测定方法的原理、试剂和材料、 仪器和设备、分析步骤、结果计算、精密度和定量限。 本标准适用于水产养殖环境（水体、底泥）中孔雀石绿的测定 2规范性引用文件 凡是 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改车 自适用于本 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 海洋监测规范 第5部分沉积物分析 RES! GB17378.5 3原理 S 孔雀石绿经硼氢化钾还原为其代谢产物隐色孔雀石绿后：水样经过滤，底泥试 合溶剂提取，所得样液加文甲 酸酸化，经固相萃取柱富集、净化.反相色谱柱分离 光检测器检测，外标法 RCH 定量。 R 4试剂和材料 4.1试剂 4.1.1水：符合CB/T 6682中一级水的要求 4. 1.2 色谱纯 乙睛（CHN） 4. 1. 3 甲醇（CH：OH 4. 1. 4 二氯甲烷(CH 谱 4. 1.5 甲酸（CH2O2）：分析 4. 1. 6 冰乙酸(CH:COOH)： 分析纯。 4. 1.7 硼氢化钾（KBH4）：分 4. 1. 8 乙酸铵(CH,COONH)： 4.2溶液配制 4.2.13%甲酸溶液：移取3mL甲酸，用水定容至 4.2. 2 硼氢化钾溶液（0.03mol/L）：称取0.081g硼氢化钾，用水溶解，定容至50mL，现用现配。 4. 2.3 硼氢化钾溶液（0.2mol/L）：称取0.54g硼氢化钾，用水溶解，定容至50mL，现用现配。 4. 2. 4 乙酸铵溶液（5mol/L）：称取38.5g无水乙酸铵，用水溶解，定容至100mL。 4.2.5 乙酸铵甲醇溶液（0.25mol/L）：移取5mL乙酸铵溶液用甲醇定容至100mL。 4.2. 6 乙酸铵缓冲溶液（0.125mol/L）：称取9.64g无水乙酸铵溶解于1L水中，用冰乙酸调pH至 4.5。 4. 2.7 80%乙晴水：量取80mL乙腈与20mL水混合。 4.3标准品 孔雀石绿草酸盐标准品[Malachitegreen0xalatesalt，2（C23H2sN2）·2（CzHO4）·CzH2O4CAS号： 1 SC/T 9435—2019 2437-29-8]：纯度≥98%。 4.4标准溶液配制 4.4.1孔雀石绿标准储备溶液：准确称取标准品，用乙睛稀释配制成100μg/mL的标准储备液，一18℃ 避光保存，有效期3个月。 4.4.2孔雀石绿标准中间溶液（1ug/mL）：吸取1.00mL孔雀石绿的标准储备溶液至100mL容量瓶， 用乙睛稀释至刻度，一18℃避光保存。 4.4.3孔雀石绿标准工作溶液：根据检测需要移取一定体积的标准中间溶液，加入0.4mL0.03mol/L 硼氢化钾溶液，用乙睛准确稀释至2.00mL，配置适当浓度的标准工作溶液。标准工作溶液需现配现用。 4.5材料 4.5.1酸性氧化铝：粒度为100目~200目（75μm~150um）。 4.5.2MCX混合型阳离子交换柱：3mL/60mg。使用前，依次用3mL乙睛、3mL甲酸溶液预淋洗。 4.5.3微孔滤膜：0.22μm，通用型。 5仪器和设备 5.1高效液相色谱仪：配荧光检测器。 5.2电子天平：感量0.0001g、感量0.01g。 5.3涡旋振荡器。 5.4超声波清洗器：频率40kHz。 5.5离心机：≥3000r/min。 5.6固相萃取装置：12孔或24孔。 5.7 pH计。 5.8可控温氮吹浓缩仪。 5.9注射器：50mL或100mL。 6分析步骤 6.1样品处理 6.1.1水样处理 水样经0.45μm滤膜过滤后，准确移取100mL水样于三角瓶中，加人1mL0.2mol/L硼氢化钾溶 液，充分振荡1min～2min，再加入3mL甲酸调节水样pH,待净化。 6.1.2底泥处理 准确称取10.00g于50mL离心管内，依次加5g酸性氧化铝、10mL乙腈和10mL二氯甲烷、 1mL0.2mol/L硼氢化钾溶液，涡旋振荡1min，超声提取10min，4000r/min离心10min，将上清液移 至100mL的三角瓶。底泥用10mL乙和10mL二氯甲烷，重复提取一次，合并上清液。收集液加入 适量甲酸，使甲酸所占样液体积分数为3%（V/V)，待净化。 另取10.00g底泥样品，按照GB17378.5中规定的方法进行含水率测定。 6.2净化 将已活化的MCX固相萃取小柱连接到固相萃取仪，将注射器通过SPE转接头连接到固相萃取柱上 端，然后将水样或底泥样液加载到注射器，让样液以小于3mL/min流速通过小柱。样品过柱后，以5mL 乙腈清洗三角瓶，转入小柱，弃去流出液，减压抽干。用5mL0.25mol/L乙酸铵甲醇溶液洗脱，减压抽 干。将洗脱液氮吹浓缩近干，用2.00mL80%乙睛水溶液溶解残渣，经过0.22μm滤膜过滤，供液相色谱 分析。 6.3测定 6.3.1色谱参考条件 2 SC/T9435—2019 a) 色谱柱：Cis柱，250mmX4.6mm（内径），5μm，或性能相当者； b) 色谱柱温：35℃； c) 流动相：乙十乙酸铵缓冲溶液（0.125mol/L，pH4.5)=（80十20，V/V)； d) 荧光检测器：激发波长265nm，发射波长360nm； e) 流速：1.5mL/min； f) 进样量：50μL。 6.3.2 色谱测定与确证 将标准工作溶液和待测溶液分别注入高效液相色谱中，以保留时间定性，以待测液峰面积代人标准曲 线中定量，样品中孔雀石绿质量浓度应在标准工作曲线质量浓度范围内。标准溶液和试样溶液色谱图参 见附录A。 6.4空白实验 PUBLI 除不加试样外，均按6.1 ~6. 3 测定步骤进行。 7结果计算 水样中孔雀石绿的含量按式) 结果需扣除空白值 保留 A A) (1) S 式中： Xi- 水样中待测组分的含量：单位为毫克每升（mg/L）： 待测组分标准工作液的浓度：单位为微克每毫升（ug/L） Cs A, 待测组分标准工作液的峰面积， A 样品中待测组分的峰面积， A 样液最终定容体积单位为毫升CmL： V。 样品体积，单位为毫升（mL） 底泥试样中孔雀石绿的含量按式（2）计算，测试结果需扣除 支留 m R 式中： 样品中待测组分的残留量， m 样品质量，单位为克（g） W 样品含水率，单位为质量分数 8精密度 在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值与其算术平均值的比值（百分率），应符合附录 B的要求。 在再现性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值与其算术平均值的比值（百分率），应符合附录 C的要求。 9定量限 水体中孔雀石绿的定量限为0.1μg/L；底泥中孔雀石绿的定量限为1.0μg/kg。 3 SC/T 9435—2019 附录A （资料性附录） 标准溶液和试样溶液色谱图 A.1孔雀石绿标准溶液色谱图 见图A.1。 响应值 12 10.202 10 8 6 0 2 4 6 8 10 12 141,min 图A.1 孔雀石绿标准溶液色谱图 A.2水体空白样品色谱图 见图A.2。 响应值 4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 0 2 4 6 8 10 12 14t, min 图A.2 水体空白样品色谱图 SC/T 9435—2019 A.3水体添加0.1μg/L孔雀石绿色谱图 见图A.3。 响应值 4.4 10.308 4.2 4.0 3.8 0 2 6 8 10 12 14 t, min 图A.3水体添加0.1μg/L孔雀石绿色谱图 A.4水体添加1ug/L孔雀石绿色谱图 见图A.4。 响应值 8 10.329 7 6 5 0 2 4 6 8 10 12 14 t, min 图A.4 水体添加1ug/L孔雀石绿色谱图 5