ICS 65.020.30 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7241-2020 鲍脓疱病诊断规程 Code of diagnosis for abalone pustule disease 2020-08-26发布 2021-01-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 SC/T 7241—2020 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部渔业渔政管理局提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本标准起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所。 本标准主要起草人：白昌明、辛鲁生、杨冰、万晓媛、王崇明、李晨、梁艳、黄健 I SC/T7241—2020 鲍脓疱病诊断规程 1范围 本标准给出了鲍脓疱病(abalone pustuledisease)的术语和定义、缩略语、试剂和材料、器材和设备、临 床症状与表现，规定了采样、组织病理检测、PCR检测及综合判定， 本标准适用于鲍脓疱病的流行病学调查、诊断、检疫和监测 2 规范性引用文件 件，仅主日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文 有的 SC/T7011 命 名规则 印片的 SC/T7205. 20 牛蛎仓 纳 胞学诊断法 3 3术语和定义 TA SC/T 7011 界定的象语 和定义适用 4 缩略语 A 下列缩略语 适甩子 bp:碱基对 basepalr DAFA：戴丝 森氏乙 醇福尔马林乙酸固 avidson ceio fixative) in-a DNA:脱 氧 糖核酸 eoxyribonu dNTPs: 酸脱氧 tide EDTA:Z minetetre PCR：聚合 式反应 eaction Taq酶：水生 TE：Tris盐酸和上 EODA xymethylaminomethan 试剂和材料 除非另有说明，标准中使用的水为蒸馏水、去离子水或相当纯度的水 5.2 无水乙醇。 5.3 TE缓冲液见附录A中的A.1。 5.4 抽提缓冲液见A.2。 5.5 蛋白酶K见A.3。 5. 6 10mol/L乙酸铵见A.4。 5.7 平衡酚。 5.8酚/氯仿/异戊醇（25：24：1)。 5.9氯仿/异戊醇（24：1)。 5. 10 1×电泳缓冲液见A.5。 5. 11 70%乙醇见A.6。 5.12 dNTPs（各2.5mmol/L)：生化试剂，含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各2.5mmol/L的混合物，一20℃ 1 SC/T 7241—2020 保存，用于PCR。 5.13 310XPCR缓冲液：生化试剂，无Mg²+，随TaqDNA聚合酶提供，一20℃保存。 5.14MgCl²(25mmol/L)：生化试剂，一20℃保存。 5. 15 5TaqDNA聚合酶（5U/μL）：生化试剂，一20℃保存。 5.16 正向引物VFtoxR-F（10μmol/L）：5'-GACCAGGGCTTTGAGGTGGACGAC-3'，一20℃保存。 5. 17 反向引物VFtoxR-R（10μmol/L）：5'-AGGATACGGCACTTGAGTAAGACTC-3'，一20℃保存 5. 18 PCR检测阳性对照为已知感染河流弧菌且PCR结果显示阳性的鲍组织样品，一70℃保存。 5. 19 PCR检测阴性对照为已知未感染河流弧菌且PCR结果显示阴性的鲍组织样品，一70℃保存。 5. 20 PCR检测空白对照以灭菌双蒸水作模板。 5.21 琼脂糖。 5. 22 DNA分子量标准。 5.23 筛绢（600目）过滤海水。 5.24 DAFA固定液见 A.7。 5.25 苏木精染色液见A.8。 5.26 61%伊红储存液见A.9。 5.27 71%焰红储存液见A.10。 5. 28 3伊红-焰红染色液见A.11。 5.29 995%乙醇。 5. 30 85%乙醇见A.12。 5.3180%乙醇见A.13。 5. 32 275%乙醇见A.14。 5.33 350%乙醇见A.15。 5.34 4二甲苯。 5.35 石蜡(熔点52℃~54℃)。 5.36中性树胶。 6器材和设备 6.1石蜡切片机。 6.2组织脱水机。 6.3包埋机。 6.4染色机。 6.5展片水浴锅。 6.6恒温箱。 6.7平板烘片机。 6.8显微镜。 6.9 PCR仪。 6.10电泳仪。 6.11水平电泳槽。 6.12紫外观察仪或凝胶成像仪。 6.13高速离心机。 6.14微量移液器。 2 SC/T7241—2020 7临床症状与表现 病鲍食欲降低，腹足上有单个或多个隆起的白色脓疱，温度升高时病情加重，脓疱破裂后流出大量白 色脓汁并留下2mm～5mm的创面。随着病程延长，足面肌肉出现不同程度的溃烂，鲍附着力下降或完 全不能附着、甚至死亡。参见附录B。 8采样 8.1采样对象 皱纹盘鲍（Haliotisdiscus）等易感品种，参见附录B。选择死或表现出第7章中所描述临床症状的 个体。 8.2采样数量、方法和保存运输 应符合SC/T7205.1—2007附录B的要求。 8.3样品采集 样本采集前使用灭菌水冲洗腹足部位，取2mm～5mm厚鲍腹足组织，立即保存于DAFA固定液 中，固定12h～24h后，进行组织病理检测或转移到70%乙醇中暂存；取30mg~50mg腹足组织，立即进 行DNA提取或暂时保存于一20℃冰箱。 9组织病理检测 9.1脱水 将组织块置于脱水机中或依次浸入盛有不同浓度乙醇溶液的容器中，流程如下：75%乙醇（1h 45min)->85%乙醇(1h45min)-→85%乙醇(1h45min)-→95%乙醇(45min)→95%乙醇(45min)→无 水乙醇(45min)→无水乙醇(45min)。 9.2透明 脱水后的组织块置于脱水机中或依次浸人盛有无水乙醇：二甲苯（1：1)混合液和二甲苯溶液的容器 中，流程如下：无水乙醇：二甲苯(1：1)(25min)→二甲苯（20min)→二甲苯(20min)。 9.3浸蜡 恒温箱温度调节至高于石蜡熔点3℃。流程如下：透明后的组织块依次浸人2个盛有融化石蜡的容 器中各80min。 9.4包埋 将包埋机或恒温箱温度调节至高于石蜡熔点3℃进行熔蜡，将熔蜡倒人包埋盒，也可用折叠纸盒；用 预温的镊子迅速夹取组织块，切面朝下平放在模具底部；轻轻提起模具，置于冰上使其冷却凝固。 9.5切片 用蜡铲或刀片将包埋块四周修平，使上下两面平行，保留组织周围附着宽2mm～3mm的石蜡。用 石蜡切片机切片，厚度5μm。对每个石蜡包埋块至少切取2张不连续的切片。 9.6展片 将切片平放于展片水浴锅水面上，待伸展平整后，用载玻片捞出，置于烘片机上或烘箱内，45℃烘片 2 h。 9.7染色 将切片放在玻片架上，置于染色机中或依次浸入盛有不同溶液的容器中，流程如下：二甲苯（5min)-→ %08( )%6( )%6( )( )( 9)由 ( )()()( )%( )%8( ) 迈尔-班尼特苏木精染色液（5min)→缓慢流动的自来水（6min）→伊红-焰红染色液（2min）-→>95%乙醇 (1min20s)→95%乙醇（2min）→无水乙醇（2min）-→无水乙醇（2min）→二甲苯（2min30s）→二甲苯 (2min30s)→二甲苯(2min30s)。 3 SC/T 7241—2020 9.8 封片 滴加2滴中性树胶封片。 9.9 观察 在光镜下观察，病鲍的腹足肌肉和结缔组织变性、坏死。受感染结缔组织细胞坏死、溶解，并出现大量 血细胞浸润，部分血淋巴细胞质膜破裂，参见附录C。 9.10 结果判定 病鲍腹足肌肉和结缔组织若出现9.9所述特征病灶，判断为鲍脓疱病疑似阳性。 10 PCR检测 10.1 DNA 的提取 10. 1. 1 取30 mg~50 mg 组织样品，加人抽提缓冲500l 充分研磨，37 7℃温浴1 h。提取过程同时设 置阳性对照、阴性对照 RD 10. 1. 2 加人 2. 5 μ g/mL蛋白 于50℃水浴3h，不时旋动。 o 10. 1. 3 将溶液冷 却至 nin离心3min分离 两相。 10.1.4水相移至新 1.6 ml 1 颠倒混合10min，于 ni0分 10000r/min 离两相 10. 1. 5 水相 硕倒混 移 新1. mL离心管中加人等体积氣价异戊醇（24 min,于10 000 r/min离心 分离两 10. 1. 6 水相移至 口新 后加人 乙酸铵油 倍体积预冷无 水乙醇（—20℃ 混匀 min离心10.min.弃上清液 C 10. 1.7 用 乙醇（4 次每次10 000r/min 去上清液 ，沉淀于室温晾干。 10. 1. 8 加人 0 L灭菌双蒸水溶解DNA? 10.1.9若DNA 00ul 液中并 10.1.10可以采用同等抽提效果的其他方法或使用商品 化DNA抽 10.2PCR扩增 10. 2. 1 PCR 反应体系:按照表 1 求： 除 ag酶以外的各 试剂,配制 成预混物，分装保存于 一20℃冰箱。临用前 Tag 酶， .2 mL PCR管中。分 别加人各样品的模板 （浓度为 照、阴性对照和空白对照。 表 1 PCR反应预混物所需试剂和组成 试剂 25μL体系 试剂终浓度 10×PCR缓冲液（无Mg2+ 1XPCR缓冲液 2.5m MgCl2(25 mmol/L) 2.5L 2.5mmol/L dNTPs（各2.5mmol/L） 2.0 μL 200 μmol/L 引物VFtoxR-F（10μmol/L) 1. 0 μL 0