ICS65.020.30 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7240—2020 牡蛎疱疹病毒1型感染诊断规程 Code of diagnosis for infection with Ostreid herpesvirus 1 2020-08-26发布 2021-01-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 SC/T 7240—2020 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部渔业渔政管理局提出 V 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本标准起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所。 本标准主要起草人：白昌明、辛鲁生、杨冰、万晓媛、王崇明、李晨、梁艳、黄健。 I SC/T7240—2020 牡蛎疱疹病毒1型感染诊断规程 1范围 本标准给出了牡蛎疱疹病毒1型（Ostreidherpesvirus1，OsHV-1）感染的术语和定义、缩略语、试剂 和材料、器材和设备、临床症状与表现，规定了采样、组织病理检测、PCR检测、透射电镜检测及综合判定。 本标准适用于牡蛎疱疹病毒1型感染的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2规范性引用文件 凡是不注日期的引用 SC/T7011 水生动物 疾病术语 名规则 SC/T7205. 20 细胞学诊断法 3术语和定义 定的 SC/T701 界 义适车 4缩略语 下列缩略语 bp：碱基对 basepai DAFA: 森氏乙 福尔马林 celid fixative) DNA:脱 糖核配 CENT dNTPs: 酸脱氧 onu EDTA:Z min Epon812:环 树脂8 代度应 PCR：聚合酶 reaction nu polymeras TE:Tris盐酸和 Tris:三羟甲基氨基 omethane 5试剂和材料 5.1 除非另有说明，标准中使用的水 纯度的水， 5.2无水乙醇。 5.3TE缓冲液见附录A中的A.1。 5.4抽提缓冲液见A.2。 5. 5 蛋白酶K见A.3。 5.610mol/L乙酸铵见A.4。 5.7平衡酚。 5.8酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）。 5.9氯仿/异戊醇（24：1)。 5.101×电泳缓冲液见A.5。 5.1170%乙醇见A.6。 1 SC/T 7240—2020 5.12dNTPs(各2.5mmol/L)：生化试剂，含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各2.5mmol/L的混合物，一20℃ 保存，用于PCR。 5.1310XPCR缓冲液：生化试剂，无Mg2+，随TagDNA聚合酶提供，一20℃保存。 5.14MgCl²（25mmol/L）：生化试剂，一20℃保存。 5.15TaqDNA聚合酶（5U/μuL）：生化试剂，一20℃保存。 5. 16 正向引物C2（10μmol/L）：5'-CTCTTTACCATGAAGATACCCACC-3'，一20℃保存 5. 17 反向引物 C6 (10 μmol/L):5'-GTGCACGGCTTACCATTTTT-3',一20℃保存。 5. 18 3PCR检测阳性对照为已知感染牡蛎疱疹病毒1型且PCR结果显示阳性的贝类组织样品，一70℃ 保存。 5. 19 9PCR检测阴性对照为已知未感染牡蛎疱疹病毒1型且PCR结果显示阴性的贝类组织样品，一70℃ 保存。 5.20 PCR检测空白对照以灭菌双蒸水作模板。 5.21琼脂糖。 5.22 2DNA分子量标准。 5. 23 3筛绢（600目)过滤海水。 5.24 4DAFA固定液见A.7。 5.25 5苏木精染色液见A.8。 5.26 1%伊红储存液见A.9。 5. 27 1%焰红储存液见A.10。 5.28 伊红-焰红染色液见A.11。 5.29 95%乙醇。 5.30 85%乙醇见A.12。 5.31 80%乙醇见A.13。 5.32 275%乙醇见A.14。 5.33 350%乙醇见A.15。 5.34 二甲苯。 5.35 石蜡（熔点52℃54℃）。 5. 36 中性树胶。 5.372.5%戊二醛见A.16。 5.38 1%酸储存液见A.17。 5. 39 丙酮。 5. 40 90%丙酮见A.18。 5. 41 170%丙酮见A.19。 5. 42 250%丙酮见A.20。 5. 43 3Epon812包埋剂。 5. 44 醋酸铀染色液见A.21。 5. 45 5柠檬酸铅染色液见A.22。 6 器材和设备 6.1 石蜡切片机。 6.2组织脱水机。 2 SC/T7240—2020 6.3包埋机。 6.4染色机。 6.5展片水浴锅。 6.6恒温箱。 6.7平板烘片机。 6.8显微镜。 6.9PCR仪。 6.10电泳仪。 6.11水平电泳槽。 6.12紫外观察仪或凝胶成像仪。 6.13高速离心机。 6.14微量移液器。 6.15超薄切片机。 6. 16 6透射电子显微镜。 7临床症状与表现 患病贝类幼虫表现活动力减弱，摄食减少，沉人容器底部；稚贝、幼贝和成贝表现双壳闭合不全，参见 附录B。 8采样 8.1采样对象 牡蛎、扇贝、蛤和蚶类等易感双壳贝类，参见附录B。优先选择濒死或双壳闭合不全的贝类样本。 8.2采样数量、方法和保存运输 应符合SC/T7205.1一2007中附录B的要求。 8.3样品采集 取内脏团；成贝(>3cm)取肝胰腺、鳃和外套膜。 8.3.2适用于组织病理检测的样品包括鳃、外套膜和肝胰腺。取2mm～5mm厚组织样本，立即保存于 DAFA固定液中，固定12h～24h后，可进行组织病理检测或转移到70%乙醇中暂存。 8.3.3适用于透射电镜检测的样品包括鳃、外套膜和肝胰腺。取0.5mm3~1mm²的组织块，立即浸人 2.5%戊二醛固定液中，4℃固定2h～4h后，可进行透射电镜检测。 8.3.4适用于分子生物学检测的样品包括鳃和外套膜。取30mg～50mg组织，立即进行DNA提取或 暂时保存于一20℃冰箱。 9组织病理检测 9.1脱水 将组织块置于脱水机中或依次浸人盛有不同浓度乙醇溶液的容器中。流程如下：75%乙醇（1h 45min）-→85%乙醇（1h45min）→85%乙醇（1h45min)→>95%乙醇（45min）-→>95%乙醇（45min）→无 水乙醇（45min）→无水乙醇（45min）。 9.2透明 脱水后的组织块置于脱水机中或依次浸人盛有无水乙醇：二甲苯（1：1)混合液和二甲苯溶液的容器 中。流程如下：无水乙醇：二甲苯（1：1)（25min）→二甲苯（20min）→二甲苯（20min）。 9.3浸蜡 3 SC/T7240—2020 恒温箱温度调节至高于石蜡熔点3℃。流程如下：透明后的组织块依次浸人2个盛有融化石蜡的容 器中各80min。 9.4包埋 将包埋机或恒温箱温度调节至高于石蜡熔点3℃进行熔蜡，将熔蜡倒入包埋盒，也可用折叠纸盒；用 预温的镊子迅速夹取组织块，切面朝下平放在模具底部；轻轻提起模具，置于冰上使其冷却凝固。 9.5切片 用蜡铲或刀片将包埋块四周修平，使上下两面平行，保留组织周围附着宽2mm～3mm的石蜡。用 石蜡切片机切片，厚度5μm。对每个石蜡包埋块至少切取2张不连续的切片。 9.6展片 将切片平放于展片水浴锅水面上，待伸展平整后，用载玻片捞出，置于烘片机上或烘箱内，45℃烘片 2 h。 9.7染色 RD 将切片放在玻片 本5 5 min)→二甲苯(5min)→> 无水乙醇(2min) 无水 Z醇hin 石醇 乙醇(2min)80%乙 醇(2min)-→50% 配 miny 2 min)→蒸馏水(2 mi 迈尔-班尼特苏木精 染色液（5min） 缓快 慢流动的 来水（6m）价 红-焰红染色液（2mm nin20 s)→95%乙 醇（2min）→无水乙 无水飞醇 2mir 甲米 2min30s）-→二甲苯 (2 min 30 s) 9.8封片 滴加2滴中 9.9 观察 在光镜 其中的成纤维细胞和血细胞呈现染色体边集 或核浓缩等细胞 9. 10 结果判定 C 外套膜、鳃和 时特！ 蛎冠疹病毒1型感染疑似 阳性。 10PCR检测 10.1 总 DNA的提 10.1.1取30mg~50mg组织样品加人抽提缓冲液500mL充分研磨，37 温浴1h。提取过程同时设 置阳性对照、阴性对照 10. 1. 2加人 2. 5 μL 20 mg/mL 蛋白酶 K,至终浓度 100 μg/mL , ，混匀后置于50℃水浴3h，不时旋动 10.1.3将溶液冷却至室温，加人等体积平衡酚,颠倒混合 10 min,于10 000 r/min离心 3min分离 两相。 10.1.4水相移至新1.5mL离心管中，加人等体积酚/氯仿/异戊醇（25：24：1)，颠倒混合10min，于 10000r/min离心1min分离两相。 10.1.5水相移至一新1.5mL离心管中，加人等体积氯仿/异戊醇（24：1)，颠倒混合10min，于10000 r/min离心1min分离两相。 10.1.6水相移至一新1.5mL离心管中，加人100μL10mol/L乙酸铵，混匀后，再加人两倍体积预冷无 水乙醇（一20℃）混匀，一20℃放置2h。10000r/min离心10min，弃上清液。 10.1.7用70%乙醇（4℃)洗涤沉淀2次，每次10000r/min离心5min，倾去上清液，沉淀于室温晾干。 10.1.8加人100μL灭菌双蒸水溶解DNA。 10.1.9若DNA样品需要保存，可溶解于100μLTE缓冲液中并保存于一20℃冰箱。 4 SC/T