ICS 65.020.30 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7239—2020 三疣梭子蟹肌孢虫病诊断规程 Code of diagnosis for microsporidiosis caused by Ameson portunus 2020-08-26发布 2021-01-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 SC/T7239—2020 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部渔业渔政管理局提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156）归口。 本标准起草单位：中国水产科学研究院东海水产研究所、浙江万里学院、江苏省海洋水产研究所、华东 理工大学。 本标准主要起草人：周俊芳、程家骅、王元、姜亚洲、房文红、焦海峰、万夕和、吉红九、李新苍、王启要、 肖婧凡、赵姝、符贵红。 I SC/T7239—2020 引言 本文件的发布机构提请注意如下事实，声明符合本文件时，可能涉及9操作步骤和附录B引物与《一 种用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预警的套式引物及其应用》（专利号：ZL 201510289724.7)等相关专利的使用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。 该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就 专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系 方式获得： 专利持有人：中国水产科学研究院东海水产研究所 地址：上海市军工路300号东海水产研究所 请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利 的责任。 ⅡI SC/T 7239—2020 三疣梭子蟹肌孢虫病诊断规程 1范围 本标准给出了三疣梭子蟹肌孢虫病（microsporidiosiscausedbyAmesonportunus）诊断所需试剂和 材料、器材和设备、临床症状，规定了三疣梭子蟹肌孢虫病的采样、组织病理学检测、PCR检测和综合 判定。 本标准适用于三疣梭子蟹肌孢虫病的鉴定，用于三疣梭子蟹肌孢虫引起的相关疾病的流行病学调查、 诊断、检疫和监测。 2规范性引用文件 下列文件对于 不可少的 凡是不注日期的引用文件，其最新版 括所有的修改单）适 GB/T6682 折实验室 用水规格和试 GB/T286 白斑综 合征CWSDD诊断规程 SC/T7103 水生动 三地检疫来样技术规范 3缩略语 适用手 下列缩略语 dNTPs: 1 核粉核 PBS:磷 冲盐溶 EDTA: PCR：聚合 链式反 Percoll:Pe 1分层 Taq：水生栖热菌Th SDS：十二烷基硫 酸 Tris:三(羟基 4 试剂和材料 4.1除特别说明外，分析所用试剂均为分析纯 F合GB/T 82中一级水的规格。 4.2DNA提取相关试剂：100%乙醇、95%乙醇、75%乙醇、Tris、HCI、EDTA、NaCI、SDS、蛋白酶K、 RNaseA(100mg/mL）、苯酚、氯仿、异戊 4.3PCR检测相关试剂:DNA分子量标准、PBS、TaqDNA聚合酶（5U/μL）、PCR反应缓冲液（10X， 20mmol/LMg2+）、dNTPs（2.5mmol/L）、上样缓冲液（6X）、电泳缓冲液。 常规PCR引物（10μmol/L)：MI1F：TGGCGACCAGTTCTAAG和MI545R：AAGCCGAACAATC- CACA; 套式PCR引物（第一轮扩增为常规PCR引物，第二轮扩增为MI230F：CARATAGATAGG GGCAGTAGC和MI426R:ATCGGTCACTGCTAGAACTAC)。 4.4组织病理学检测相关试剂：中性树胶、DAFA固定液、苏木精染色液、1%伊红储存液、1%焰红储存 液、伊红-焰红染色液、粘片剂、100%乙醇、95%乙醇、85%乙醇、80%乙醇、75%乙醇、50%乙醇。 4.5组织病理学检测用阳性对照为确诊三疣梭子蟹肌孢虫病且显示明显病理变化的蟹肌肉组织切片； PCR检测用对照：阳性对照为确诊三疣梭子蟹肌孢虫病的蟹肌肉组织，一80℃保存，阴性对照为经套式 1 SC/T 7239—2020 PCR检测未感染三疣梭子蟹肌孢虫的健康蟹肌肉组织，一80℃保存，空白对照为ddH2O。 4.6以上配制试剂按附录A的规定执行；引物对应靶基因序列及其扩张片段参见附录B。 5器材和设备 5.1切片机。 5.2组织脱水机。 5.3包埋机。 5.4染色机。 5.5展片水浴锅。 5.6烘片机。 5.7光学显微镜。 5.8组织破碎仪或研磨机。 5.9 PCR扩增仪。 5.10高速冷冻离心机。 5.11纯水仪。 5. 12 2恒温水浴锅。 5.13生物安全柜。 5.14电泳仪。 5. 15 5凝胶成像系统或紫外观察仪。 5.16 6超微量分光光度计。 6 临床症状 三疣梭子蟹肌孢虫病发病蟹摄食量减少，个体消瘦，防御、自洁和摄食等行为受到严重影响，腹面和附 肢关节外观失去透明感，检可见肌肉白浊、不透明，甚至完全白浊化，参见附录C。 7采样 7.1采样对象 三疣梭子蟹， 7.2采样数量 采样数量应符合SC/T7103的规定。 7.3采样方法和保存运输 揭开三疣梭子蟹头胸甲，剪取小块肌肉，收集于离心管中。采集样品的封存和运输应符合SC/T7103 的规定。 7.4样品采集 用于组织病理学检测的肌肉样品（<1cm3），用DAFA固定液固定24h以上，固定液体积是组织体 积的10倍以上；用于PCR检测的肌肉样品（50mg~100mg），用95%乙醇保存。 8组织病理学检测 8.1修块 样品固定方法和切片前的取材修整，宜符合GB/T28630.4的要求。 8.2脱水 75%乙醇(1 h 45 min)-→>85%乙醇(1 h 45 min)→>85%乙醇(1 h 45 min)→95%乙醇(45 min)-→>95% 乙醇（45min）→无水乙醇（45min）→无水乙醇（45min）。 2 SC/T 7239—2020 8.3透明 100%乙醇：二甲苯(1：1)(25min)→二甲苯（20min）→二甲苯(20min）。 8.4浸蜡 纯石蜡（1h20min）→>纯石蜡（1h20min）。 8.5包埋、切片 将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋，包埋好的蜡块修整后置于切片机上切片，片厚5um。对每个 石蜡包埋块至少切取2块不连续的切片。 8.6 展片 40℃下展片，用涂有一层粘片剂的载玻片捞出，置于平板烘片机上于45℃烘片2h。 8.7染色 二甲苯(5min)→二甲苯（5min)→100%乙醇（2min)→100%乙醇（2min)-→95%乙醇（2min)→ 95%乙醇（2min)→>80%乙醇（2min）→80%乙醇（2min）→50%乙醇（2min）)→蒸馏水（2min）→蒸馏水 ） (2min）→>95%乙醇（1min20s)→95%乙醇（2min）-→100%乙醇（2min）→100%乙醇（2min）→二甲苯 (2 min 30 s)→二甲苯(2 min 30 s)→二甲苯(2 min30 s)。 8.8 封片 滴加2滴中性树胶封片。 8.9观察 光学显微镜下观察、拍照。 8.10结果判定 8.10.1正常三疣梭子蟹肌肉组织切片中肌细胞质染成红色，细胞核染成蓝色，肌原纤维排列整齐，无断 裂、溶解现象。 8.10.2三疣梭子蟹肌孢虫病发病蟹的肌肉组织可见肌原纤维断裂、溶解，肌原纤维间隙分布大量红色、 直径为1.0μm~1.4μm的椭球形孢子，参见附录C。 9PCR检测 9.1总DNA提取 9.1.1取50mg～100mg肌肉组织样品，加人250μLPBS和少量玻璃珠，6500r/min30s匀浆处理2 9.1.2将200μL裂解液和20μL蛋白酶K加人上清液，56℃水浴2h～4h。 9.1.3加人RNaseA至终浓度20μg/mL，60℃水浴30min。 9.1.5取上清液，转移至一个新的2mL离心管中，加人等体积氯仿/异戊醇（24：1)混合10min，12000 r/min离心5min。 9.1.6取上清液，加人2倍～2.5倍体积的100%乙醇，颠倒混匀，12000r/min离心5min，去上清液。 9.1.7加人300μL75%乙醇，漂洗沉淀2次。 9.1.8加入300uL100%乙醇漂洗沉淀，12000r/min离心5min后，尽可能去除全部液体，室温干燥。 9.1.9根据沉淀量加人30μL～50μL的ddH2O，使DNA完全溶解。 9.1.10取2μL样品DNA溶液使用超微量分光光度计测定OD值。将DNA分装，置于一20℃保存 9.1.11可以采用同等抽提效果的其他方法或使用商品化DNA抽提试剂盒。提取过程同时设置阳性对 照、阴性对照和空白对照。 9.2常规PCR检测 9.2.1常规PCR反应体系见表1。配制好的反应液置于普通PCR扩增仪内，按如下程序扩增：95℃ 3 SC/T7239—2020 5min；95℃45s，47℃35s，72℃40s，循环25次；72℃延伸5min；4℃保温。阳性对照、阴性对照和空白 对照与样品的体系和程序相同。 表1三疣梭子蟹肌孢虫病常规PCR检测反应体系 试剂 添加量 TaqDNA聚合酶(5U/μL) 0. 25 μL 10XPCR缓冲液（Mg+20mmol/L) 5 μL dNTPs(各2.5mmol/L) 4 μL 引物MI1F(10μmol/L) 5 μL 引物MI545R(10μmol/L) 5 μL DNA模板 2 μL 注：添加ddHz0至总体积50 9.