ICS 65.020.30 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7238-2020 对虾偷死野田村病毒（CMNV）检测方法 Detection methods for covert mortality nodavirus (CMNV) 2020-08-26发布 2021-01-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 SC/T 7238—2020 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 典通 本标准由农业农村部渔业渔政管理局提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本标准起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所。 本标准主要起草人：张庆利、黄健、万晓媛、李小平、刘爽、梁艳、杨冰、邱亮、李晨。 一 SC/T7238—2020 对虾偷死野田村病毒（CMNV）检测方法 1范围 本标准给出了对虾偷死野田村病毒（CMNV)逆转录套式PCR检测、逆转录环介导等温扩增检测、 TaqMan荧光定量RT-PCR检测所需的试剂和材料、器材和设备，规定了操作步骤和结果判定的要求。 本标准适用于CMNV的检测和监测 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的 凡是不注日期的引用文件 SC/T7103水生 动物 检疫采 3缩略语 下列缩略语通 BstDNA聚 .BCO 热启动DNA聚合酶BS tart CMNV:偷 田村病 Ccovertnorialinynodavi dNTP:脱拿 二磷 Cdeoxyribonucleos M-MLV酶 单转莱酶reverse transcr M MLV RNase nestedRT R.逆转 式PCR(nested anscriptionPCR qRT-PCR 寸荧光 t PcRcquantitativere PCRL nserip RT-LAMP 转录环 (plification) D 4试剂和材料 C 4. 1 RNase-free 商品化 4. 2 RNAisoPlus 或其他等效！ RNA提 4. 3 RNA酶抑制剂 asin ，或其他等效试剂。 4. 4 三氯甲烷：分析纯 4.5 异丙醇：分析纯。 4. 6 75%乙醇：见附录A中的 4.7 阳性对照：感染了CMNV的对虾组织或细胞培养物或含有口的片段的核酸，一80℃保存。 4.8 阴性对照：不含CMNV的对虾组织或细胞培养物：一80℃保存 4. 9 空白对照：可用RNase-free水作为空白对照。 4. 10 dNTP（各2.5mmol/L）：含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各2.5mmol/L的混合物，一20℃保存。 4. 11 dNTP（各10mmol/L)：含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各10mmol/L的混合物，一20℃保存。 4. 12 dNTP（各20mmol/L)：含dATP、dTTP、dCTP、dGTP各20mmol/L，见A.2，一20℃保存。 4. 13 M-MLV逆转录酶（200U/uL）：商品化试剂，一20℃保存，或其他等效逆转录酶。 4. 14 5XM-MLV逆转录酶缓冲液：商品化试剂，一20℃保存，或其他等效缓冲液。 4. 15 TaqDNA聚合酶（5U/μuL)：商品化试剂，一20℃保存，或其他等效DNA聚合酶。 4. 16 10XPCR缓冲液：商品化试剂，随TaqDNA聚合酶提供，不含Mg²+，一20℃保存，或其等效缓 冲液。 1 SC/T 7238—2020 4. 17 7MgCl2（25mmol/L）：一20℃保存。 4.18琼脂糖：电泳级。 4.196×载样缓冲液：商品化试剂，或其他等效载样缓冲液 4.20DNAMarker：商品化试剂，一20℃保存，或其他等效Marker。 4.21 电泳核酸染料：生化制剂。 4. 22 10o×IsothermalAmplificationBufer：商品化产品，稀释为1X×工作液时内含20mmol/LTris HCl，50mmol/LKCl,10mmol/L（NH,）2SO，2mmol/LMgSO，0.1%Tween20；或其他等效试剂。 4.23BstDNA聚合酶：商品化试剂，酶浓度8U/μuL，一20℃保存，或其他等效聚合酶。 4.24 甜菜碱（Betaine）：浓度5mol/L，见A.3，一20℃保存。 4.25 硫酸镁（MgSO）：浓度100mmol/L，一20℃保存。 4.26 荧光定量PCR核酸染料：2oXEvaGreen，商品化试剂，4保存，或其他等效核酸染料。 存，或其他等效缓冲液 4.28荧光定量PCRTaqDNA聚合酶（5U/μL)：适用于qRT-PCR，一20℃保存。 4.29检测方法的引物和探针序列参见附录B，按各方法中的工作浓度配制，一20℃保存。 5器材和设备 5.1可调移液器。 5.2冷冻离心机。 5.3 涡旋振荡器。 5.4 普通冰箱。 5.5 一80℃超低温冰箱。 5.6手掌型离心机。 5.7PCR仪。 5.8电泳仪。 5.9水平电泳槽。 5.10紫外观察仪或凝胶成像仪。 5.11实时荧光定量PCR仪。 6操作步骤 6.1样品采集 6.1.1采样对象 凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）、中国明对虾（Fenneropenaeuschinensis）、日本囊对虾（Marsu penaeusjaponicus）、斑节对虾（Penaeusmonodon）和脊尾白虾（Eropalaemoncarinicauda）等易感宿主， 其他易感生物参见C.2。 6.1.2采样数量 采样数量符合SC/T7103的要求。 6.1.3采样部位 对有临床症状（参见C.3)的虾取肝胰腺、鳃、附肢和肌肉组织。对无临床症状的虾取肝胰腺、鳃和 附肢。 6.2样品处理 用刀片切取30mg靶组织，置于1.5mL无RNA酶的EP管中。 2 SC/T7238—2020 6.3RNA提取 6.3.1取30mg~50mg样品，加入0.5ml~1mLRNAisoPlus试剂，研磨，室温放置5min。4℃下， 12000r/min离心5min。取上清液至新的无RNA酶离心管中。提取过程同时设置阳性对照、阴性 对照。 6.3.2加入1/5体积的氯仿，混合至溶液乳化呈乳白色，室温放置5min。 6.3.34℃12000r/min离心15min。缓慢吸取上层水相，移至新的无RNA酶离心管中。 6.3.4 加入等体积的异丙醇（使用前预冷至一20℃），上下颠倒混匀，室温放置10min。 6.3.54℃12000r/min离心10min，弃上清液 6.3.6加人1mL无RNA酶的75%乙醇（4℃预冷），上下颠倒洗涤沉淀，再于4℃7000r/min离心 5min，小心弃上清液。室温晾干沉淀。 6.3.7加人20L~100μ RNase-free水溶角沉旋回提取完成后测定RNA浓度和质量，将RNA稀 释为100ng/μL~200ng μL,稀释后的RVA可 6.3.8可以使用同等 6.4NestedRT-PCR检测 6.4.1cDNA合成 6.4.1.1在PCR 前 区的冰盒 配制R预变体 uL无RNA酶 的水、1μL10n RE保存厅 m 总开 200ng的待测 RNA。70℃预 10 mih 即刻放人冰浴电冷印 设置阳性对 对照和空白对照。 6.4.1.2在PCR 前区内 盒工配制通转录酶混物 方法为2 逆转 录酶缓冲液、 mam 0. 5 μL dNTP( l RNase nhibito (40 LMMEV 酶（200U/μL），加 胜保系 0.75L无RNA 并混勺将该预混物加至主述金有RNA预 系的反应管中，稍离 心，置于42℃金属 工 6.4.2第一轮 PC R扩增 6.4.2.1在PCR 区接 求加大 冰盒上配制成 nested RT-PCR PCR的无酶反应大体积的预混物 分装保荐 用前，加入相应 体积的TaqDNA 分装到 卡分 人1μL样品cD NA。 U 混物所需试齐 试剂 用样量·山 试剂终浓度 10XPCR缓冲 1XPCR缓冲液 MgClz（25 mmol/L) 2.0mmol/L dNTP(各2.5mmol/L) 2. 0 200 μmol/L 引物 CMNV-n-FI(10 μmol/L) 1.0 0.40 μmol/L 引物 CMNV-n-R1(10μmol/L) 1.0 0. 40 μmol/L 灭菌双蒸水 15. 3 TaqDNA聚合酶（5U/μL） 0. 2 0. 04 U/L, 6.4.2.2如果PCR仪不具备热盖功能，再向各管内加人50μL液体石蜡。 6.4.2.3将上述加有转录cDNA的PCR管带人PCR后区，按以下程序进行扩增：94℃预变性4min； 94℃20s、50℃20s、72℃40s，35个循环；72℃5min，最后4℃保温。准备进行产物的电泳。 6.4.2.4可以使用具有同等逆转录或一步法逆转录PCR效果的商品化试剂盒进行操作。 6.4.3第二轮PCR扩增 按照表2的要求，在冰盒上配制除TagDNA聚合酶以外的大体积预混物，分装保存于一20℃。在临 用前，加入相应体积的TaqDNA聚合酶，混勾，按24μL/反应分装到0.2mLPCR管中，试剂及反应混 3 SC/T 7238—2020 合物在操作时务必处于低温状态。分别加入1μuL第一步反应产物为模板，加前可先根据第一步PCR 产物浓度，做10倍~1000倍稀释。扩增程序为：95℃预变性4min；95℃变性20s、52℃退火30s、72℃延 伸30s，35个循环；72℃延伸5min；最后4℃保温。准备进行产物的电泳。也可以使用同等逆转录