ICS 65.020.30 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7237-2020 虾虹彩病毒病诊断规程 Code of diagnosis for infection with Decapod iridescent virus 1 2020-08-26 发布 2021-01-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 SC/T7237—2020 前 通 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 典 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发希机构不承担识别这些专利的责任 本标准由农业农村部渔业渔政管理局提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本标准起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所。 本标准主要起草人：邱亮、梁艳、黄健、陈蒙蒙、杨冰、万晓媛、张庆利。 I SC/T7237—2020 虾虹彩病毒病诊断规程 1范围 本标准给出了虾虹彩病毒病(infectionwithDecapodiridescentvirus1)诊断所需试剂和材料、器材和 设备、临床症状，规定了采样、组织病理学检测、套式PCR检测和综合判定的要求。 本标准适用于虾虹彩病毒病的流行病学调查、诊断和监 2规范性引用文件 凡是不注日期的引用 最新版长包 GB/T28630.4 201 白斑综 书 病理学诊断法 3缩略语 下列缩略语 bp:碱基又 b DIV1：十足目虫 虹彩病 Cdecapo DNA:脱 氧林 糖枝酸 deoxyribonucle dNTPs: 核艇核 脱 EDTA: 胺四乙酸 Cethy inetetra PCR:聚 销式反 SDS:十 Taq酶：水 栖热菌 nu Tris:三羟 氨基 xymethyla minom tane TETris盐酸 TOH 试剂和材料 4.1 除非另有说明，标 全中使用的水为蒸馏水、 准 子水或相当纯度的水， 4.2 二甲苯：分析纯。 4.3石蜡（熔点52℃~54℃）：切片级。 4.4中性树胶。 4.5 戴维森氏AFA(Davidson'sAFA)固定液：见附录A中的A.1。 4.6苏木精染色液：见A.2。 4.71%伊红储存液：见A.3。 4.81%焰红储存液：见A.4。 4.9 伊红-焰红染色液：见A.5。 4.10粘片剂：见A.6。 4.11无水乙醇：分析纯。 4. 12 295%乙醇：分析纯。 4. 13 85%乙醇：见A.7。 4.1480%乙醇：见A.8。 SC/T 7237—2020 4. 15 575%乙醇：见A.9。 4.1650%乙醇：见A.10。 4.17组织病理学检测阳性对照为感染DIV1且有明显病理变化的对虾头胸部组织切片。 4. 18 B组织病理学检测阴性对照为未感染DIV1的正常对虾头胸部组织切片。 4. 19 9TE缓冲液：见A.11。 4. 20 抽提缓冲液：见A.12。 4.21 蛋白酶K：见A.13。 4. 22 210mol/L乙酸铵：见A.14。 4.23 3Tris饱和酚（pH≥7.8)：分析纯 4.24 酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：分析纯。 4.25 氯仿/异戊醇（24：1)：分析纯。 4.26dNTPs(各2.5mmol/L)，含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各2.5mmol/L的混合物，一20℃保存。 4.2710XPCR缓冲液,无Mg2+，随Tag酶提供，一20℃保存。 4.28 MgCl²(25 mmol/L),一20℃保存。 4.29 9Tag酶(5U/μL)，一20℃保存。 4.30套式PCR使用2对引物，引物浓度为10μmol/L。其中,外侧引物F1和R1,扩增457bp片段;内 侧引物F2和R2，扩增129bp片段。引物序列如下： 引物F1:5'-GGG-CGG-GAG-ATG-GTG-TTA-GAT-3'; 引物 R1:5'-TCG-TTT-CGG-TAC-GAA-GAT-GTA-3'; 引物 F2:5'-CGG-GAA-ACG-ATT-CGT-ATT-GGG-3'; 弓I物R2:5'-TTG-CTT-GAT-CGG-CAT-CCT-TGA-3'。 4.31以十足目生物DNA中的848bp片段为内参。引物浓度为10μmol/L,序列如下： 引物F3:5'-TGC-CTT-ATC-AGC-TNT-CGA-TTG-TAG-3'; 引物 R3:5'-TTC-AGN-TTT-GCA-ACC-ATA-CTT-CCC-3'。 注：N表示G、A、T或C 4.32套式PCR检测阳性对照为已知感染DIV1且套式PCR结果显示阳性的对虾组织样品，一80℃ 保存。 4.33套式PCR检测阴性对照为已知未感染DIV1的对虾组织样品，一80℃保存。 4.34套式PCR检测空白对照为水。 4.3550X电泳缓冲液：见A.15。 4.36 61×电泳缓冲液：见A.16。 4.37琼脂糖：生化试剂。 4.38DNA分子量标准：生化试剂。 4.39 96×载样缓冲液：生化试剂。 4.40电泳核酸染料：生化制剂。 5器材和设备 5.1切片机。 5.2组织脱水机。 5.3包埋机。 5.4染色机。 5.5展片机。 2 SC/T7237—2020 5.6平板烘片机。 5.7光学显微镜。 5.8恒温箱 5.9 PCR仪。 5.10电泳仪。 5.11水平电泳槽。 5. 12 紫外观察仪或凝胶成像仪。 5. 13 高速冷冻离心机。 5. 14 水浴锅或金属浴。 5. 15 普通冰箱。 5. 16 一80℃超低温冰箱。 5. 17 电炉或微波炉。 5. 18 微量移液器。 61 临床症状 濒死的虾失去游动能力，沉人池底。发病个体的肝胰腺萎缩、颜色变浅，空肠空胃。患病罗氏沼虾的 额剑基部组织呈典型的白色病变。部分患病凡纳滨对虾出现红体症状。随着病程的发展，表现出高死亡 率。参见附录B。 7采样 7.1采样对象 凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）、罗氏沼虾（Macrobrachiumrosenbergi）和克氏原螯虾（Pro cambarusclarkii）等易感宿主。参见附录B中的B.3。 7.2采样数量、方法和保存运输 应符合GB/T28630.4—2012中附录B的要求。 7.3样品的采集 7.3.1组织病理学检测时，采集造血组织、鳃和肝胰腺 7.3.2套式PCR检测时，仔虾采集除眼球和眼柄外的完整个体；幼虾至成虾阶段采集头胸部（鳃、肝胰 腺、造血组织）、附肢或血淋巴。亲虾的非致死检测采集血淋巴、附肢或粪便。仔虾可以合并样本检测，个 体稍大的虾可按个体进行检测。所取样品分别置于1.5mL离心管中，立即进行DNA提取操作或暂时保 存于一20℃。 8组织病理学检测 8.1样品准备 样品固定方法和切片前的取材修整，应符合GB/T28630.4一2012中附录B的要求。 8.2脱水 75%乙醇(1h45min)→85%乙醇(1h45min)→85%乙醇(1h45min)-→95%乙醇(45min)→95% 乙醇（45min)→无水乙醇（45min)→无水乙醇（45min）。 8.3透明 无水乙醇：二甲苯（1：1)（25min)→二甲苯（20min）-→二甲苯（20min）。 8.4浸蜡 纯石蜡（1h20min)→纯石蜡（1h20min）。 8.5包埋 3 SC/T 7237—2020 用包埋机进行包埋。 8.6切片 用切片机切片，厚度5μm。对每个石蜡包埋块至少切取2块不连续的切片。 8.7展片 展片机（40℃）中展片，用涂有一层粘片剂的载玻片捞出，置于平板烘片机45℃烘片2h。 8.8染色 二甲苯（5min）→二甲苯（5min）→无水乙醇（2min)-→无水乙醇（2min）→95%乙醇（2min）→95%乙醇 (2min)-→80%乙醇（2min）-→80%乙醇（2min）→50%乙醇(2min）→蒸馅水（2min）→蒸馏馅水（2min)→蒸馏 水（2min)→苏木精染色液（5min）→缓慢流动的自来水（6minm）→伊红-焰红染色液（2min）→95%乙醇 (1min20 s)-→95%乙醇(2min)-无水乙醇(2 min 无水乙醇（2min）→二甲苯（2min30s）→二甲苯 (2min30s）→二甲苯（2min30s）。 8.9 封片 滴加2滴中性树胶封片 8.10观察 光学显微镜 观雾 8.11 结果判定 胞及部分工皮细胞内形成细胞质嗜酸性仓 患病虾的造血 L组织血 包 道有细胞核的固缩。虾 虹彩病毒病组 织病 理学图 参见附录C 9 套式 PCR 检测 9.1DNA的提 9. 1. 1 取 30 组织样品加抽损 欧充分研磨： 温浴 提取过程同时设 置阳性对照、 C 9. 1.2 加入 9.1.3将溶液 等体积Tris饱和酚，颠倒混合 006T7 10 nin 离心3min分离 两相。 TE 9.1.4水相移至亲 等体积酚/氯仿/异戊醇 颠倒混合10min， 10000r/min离心 in.分离两相 9.1.5水相移至一 mL离 1加人等体积氯仿异戊醇（24 ，颠倒混 10min,于10 000 r/min 离心1min分离两相。 9. 1. 6 水相移至一新 1.5 100 10mol/L乙酸铵 匀后，再加入2倍体积预冷无 水乙醇（一20℃）混勺，一20℃放置 10000 r/min离心10min 上清液。 9. 1.7 用 70%乙醇洗涤沉淀 2 次,每次洗涤后 10 000 1/min离心 5 min,弃上清液。DNA 沉淀于室温 晾干。 9.1.8加人100μL灭菌双蒸水溶解DNA，待用。 9.1.9若DNA样