ICS 65.020.30 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7236—2020 对虾黄头病诊断规程 Code of diagnosis for infection with yellow head virus genotype 1 2020-08-26发布 2021-01-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 SC/T7236—2020 业 言 典通 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 食工 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部渔业渔政管理局提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本标准起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所。 本标准主要起草人：杨冰、万晓媛、董宣、黄健、梁艳、张庆利、李晨、刘莉。 I SC/T7236—2020 对虾黄头病诊断规程 1 范围 本标准给出了对虾黄头病诊断（Infectionwithyellowheadvirusgenotype1）的术语和定义、缩 略语、试剂和材料、器材和设备、临床症状，规定了采样、组织病理学检测、套式RT-PCR检测和综合 判定。 本标准适用于黄头病毒基因1型（Yellowhe virus genotype 1 YHV1)引起的对虾黄头病流行病 学调查、诊断和监测。 PUBLI 2规范性引用文件 ARD 下列文件对于 文件的应用是必 不可 又注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的弓 用文 件，其最新版本 包括所有的修改单）适 GB/T2863 2012白 诊断夫 4部分 诊困 SC/T701 生动物疾病术语与命名规则 SC/T7228 2019 染性肌坏死病诊断规程 3术语和定 A 界定的 SC/T 7011 4 缩略语 下列缩略语 适用于 bp:碱基又 cDNA：互补 ntary DAFA：戴维森 cidfixative) DEPC:焦碳配 ER DNA：脱氧核糖核 酸(deo aC10 dNTPs:脱氧核糖核 三磷酸 onus cleoside triphosphate EDTA：乙二胺四乙 hylenediamine GAV：鳃联病毒（gill-as tedvirus M-MLV:莫洛尼鼠白血病病毒（moloney-murineleukemin） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） RNA：核糖核酸(ribonucleicacid) RT-PCR：逆转录-聚合酶链式反应（reversetranscription-polymerasechainreaction） SPF：无特定病原体（specificpathogenfree) Tag酶：水生栖热菌DNA聚合酶（ThermusaquaticusDNApolymerase） 5试剂和材料 5.1除非另有说明，文件中使用的水为蒸馏水、去离子水或相当纯度的水。 5.2二甲苯：分析纯。 5.3中性树胶。 5.4DAFA固定液：见附录A中的A.1。 SC/T 7236—2020 5.5苏木精染色液：见A.2。 5.61%伊红储存液：见A.3。 5.71%焰红储存液：见A.4。 5.8伊红-焰红染色液：见A.5。 5.9粘片剂：见A.6。 5.1095%乙醇：分析纯。 5.1185%乙醇：见A.7。 5.1280%乙醇：见A.8。 5. 13 375%乙醇：见A.9。 5.1470%乙醇：见A.10。 5.1550%乙醇：见A.11。 5. 16 组织病理学检测阳性对照为受 YHV 1 感染且显示明显病理变化的对虾头胸甲组织切片。 5.17 组织病理学检测阴性对照为未受YHV1感染的健康对虾头胸甲组织切片。 5.18DEPC水：见A.12的规定或商品化试剂。 5. 19 9总RNA提取试剂或其他等效产品。 5.20 RNA 酶抑制剂(RNasin或 RNase Inhibitor,40 U/μL)，-20℃保存。 5.21 M-MLV逆转录酶(200 U/μL),一20℃保存。 5.22 25×M-MLV逆转录酶缓冲液，-20℃保存。 5. 23 dNTPs(各 10 mmol/L),含 dATP、dTTP、dGTP、dCTP各 10 mmol/L的混合物，一20℃保存,用 于逆转录。 5.24 dNTPs(各2.5 mmol/L),含 dATP、dTTP、dGTP、dCTP各 2. 5 mmol/L的混合物，一20℃保存, 用于PCR。 5.2510×PCR缓冲液，无Mg2+，一20℃保存。 5.26 MgCl2(25 mmol/L)，一20℃保存。 5.27 Tag酶(5 U/μL)，一20℃保存。 5.28套式RT-PCR检测阳性对照为已知受YHV1感染且套式RT-PCR结果显示阳性的对虾组织 RNA，一70℃保存。 5.29套式RT-PCR检测阴性对照为SPF对虾组织RNA，一70℃保存。 5.30套式RT-PCR检测空白对照为DEPC水。 5.315 50X电泳缓冲液：见A.13。 5.321X电泳缓冲液：见A.14。 5.336 6X载样缓冲液。 5.34琼脂糖。 5.35DNA分子量标准。 5.36王 琼脂糖凝胶电泳核酸染料及其他等效产品。 6 器材和设备 6.1切片机。 6.2组织脱水机。 6.3包埋机。 6.4染色机。 2 SC/T7236—2020 6.5展片水浴锅。 6.6平板烘片机。 6.7显微镜。 6.8 PCR仪。 6.9电泳仪。 6.10 水平电泳槽。 6.11紫外观察仪或凝胶成像仪。 6. 12 高速冷冻离心机。 6.13水浴锅或金属浴。 6. 14 微量移液器。 71 临床症状 死虾体表发白，头胸甲因肝胰腺变黄而呈黄色，与正常虾的褐色肝胰腺相比较软。参见附录B。 8采样 8.1采样对象 斑节对虾（Penaeusmonodon）、凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）、细角滨对虾（L.stylirostris）、 短刀小长臂虾（Palaemonetespugio）和近缘新对虾（Metapenaeusaffinis）等易感品种，优先选择濒死虾或 具有临床症状的虾。参见附录B。 8.2采样数量、方法和保存运输 应符合GB/T28630.4—2012中附录B的要求。 8.3样品采集 组织病理学检测的样本，选取鳃、淋巴器官、胃、触角腺、性腺、神经管和神经节及肠道。快速浸人 DAFA固定液中固定，24h后换人70%乙醇中长期保存。 套式RT-PCR检测的样本，优先选取淋巴器官和鳃，也可选取血淋巴、触角腺、性腺、神经管和神经节 及肠道。亲虾的非致死检测取鳃和血淋巴。所取样品立即进行RNA提取或暂时保存于一20℃以下。采 样时，稍大的虾取个体检测，仔虾或未达到0.5g的样品可合并样本。 9组织病理学检测 9.1操作方式 使用6.1～6.6中设备或手动操作完成。 9.2修块 样品切片前的取材修整，应符合GB/T28630.4一2012中附录B的要求，保证病灶部位能被有效地 切片。 9.3脱水 75%乙醇(1h45min)→85%乙醇(1h45min)→85%乙醇(1h45min)-→95%乙醇(45min)->95% 乙醇（45min）→无水乙醇（45min)→无水乙醇（45min）。 9.4透明 9.5浸蜡 纯石蜡（1h20min)-→>纯石蜡（1h20min）。 9.6包埋 9.7切片 SC/T 7236—2020 厚度5μm。对每个石蜡包埋块至少切取2片不连续的切片。 9.8展片 宜40℃展片，用涂有一层粘片剂的载玻片捞出，置于平板烘片机上于45℃烘片2h。 9.9染色 二甲苯（5min）-→二甲苯（5min）→无水乙醇（2min）→无水乙醇（2min）-→95%乙醇（2min）→95% 乙醇（2min）-→80%乙醇（2min）→80%乙醇（2min）→50%乙醇（2min）→蒸馏水（2min）-→蒸馏水 (2min)-→蒸馏水（2min）→苏木精染色液（5min）-→缓慢流动的自来水（6min）-→伊红-焰红染色液 (2min)-→95%乙醇(1min20s）→95%乙醇（2min)→无水乙醇（2min）→无水乙醇（2min)→二甲苯 (2min30 s)→二甲苯(2min 30 s)→ 甲苯（2min30s） 9.10封片 滴加2滴中性树胶封片 9.11观察 显微镜下观察 9. 12 病理诊断 虾外胚层和片 中胚层组织器官 巴器官、血淋巴、胃、触角 腺、神冬管和神经节及肠道)出现广 泛坏死，坏死区域可！ 12 m或略小，淋巴器 官、胃上皮组织和鳃组尤 典型判定为疑似YHV工感染 对虾黄头病 例，参见附录C。 10套式RT- PCR 检测 A 10.1 RNA 10. 1.1 取 30 淋 祥品 857228 规定提取RNA。 g 10.1.2可采用 同等抽提效果的其他方法或使用商品化RNA提取试剂盒 10.2 套式 RT- CR 10.2. 1 逆转录 在每个0. 应亿 mol/L)0. 7 μL、 DEPC水 4. 3 μ 生对照、阴性对照 和空白对照。混 min后 人冰浴中冷去 各管中依次加人 5XM-MLV逆转 酶 转录酶（200U/μL） 0. 5 μL、RNase Inhib U ito 和DEPC水0.75I 可后， 水浴锅或金属浴中42℃ 1h、70℃15min后，可获得cDNA模 10.2.2第一步PCR 按照表1中引物序列，配制第 步 PCR反应体系,分装到 PCR 分别加人cDNA模板。25μL PCR反应体系，包括10X