ICS 65.020.30 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7235—2020 罗非鱼链球菌病诊断规程 Code of diagnosis for tilapia streptococcosis 2020-08-26发布 2021-01-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 SC/T7235—2020 前业 平台 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起靠。 承 本标准由农业农村部渔业渔政管理局提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156归Y。 本标准起草单位：中国水产科学研究院珠江水产研究所 本标准主要起草人：张德锋、石存斌、刘鹏威、任燕、王庆、曾伟伟、潘厚军、常藕琴 1 SC/T7235—2020 罗非鱼链球菌病诊断规程 1范围 本标准给出了罗非鱼链球菌病诊断所需试剂和材料、器材和设备、临床症状，规定了采样、细菌分离与 纯化培养、生理生化鉴定、PCR检测与综合判定等方法， 本标准适用于罗非鱼链球菌病的流行病学调查、诊断和监测， 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的P儿表B日期的引用义件·仪 注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文 GB 4789.9 食品 安全 食品微生物 全国家东 微生物学 和试的质 GB4789.28 美品安 量要求 SC/T7014 水生动生 验技术规范 SC/T7201 06人 细菌病栓 程 S 3 缩略语 下列缩略 16SrRN S 核糖 本RNACE ribosom BHI:脑心 夜肉汤坊 bp：碱基文 CTAB: ammonium DNA：脱拿氧 唐核酸 dNTPs：脱氧 磷酸（deox EDTA:乙 H202：过氧化 PCR：聚合酶钳 SDS：十二烷基硫酸钠（sodi Taq酶：水生栖热菌 nus Dalmerase Tris:三羟甲基氨基甲 ris hydro ninomethane) V.P：伏-普反应(Voges-Pr uertest) 名乙酰用基 醇试验 4试剂和材料 4.1 除非另有说明，标准中使用的水为蒸馏水、去离子水或与其相当纯度的水。 4.216SrRNA基因序列扩增引物27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，1492R：5'-TACG GYTACCTTGTTACGACTT-3'，一20℃保存。 4.3dNTPs（各10mmol/L），含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各10mmol/L的混合物，一20℃保存。 4.410XPCR缓冲液，无Mg?+离子，一20℃保存。 4.5TaqDNA聚合酶（5U/μL)，-20℃保存。 4.6细菌生化鉴定管或生化鉴定卡，商品化试剂。 4.7 脑心浸液肉汤琼脂培养基见附录A中的A.1。 4.8血琼脂平板见A.2。 SC/T7235—2020 4.9TE缓冲液(pH8.0)见A.3。 4.10 10%SDS溶液见A.4。 4.11蛋白酶K(20mg/mL)见A.5。 4. 12 2CTAB/NaCI溶液见A.6。 4. 13 350×TAE电泳缓冲液见A.7。 4. 14 13%过氧化氢（H2O2)溶液见A.8 4. 15 5半固体琼脂应符合GB4789.28—2013中2.8的规定。 5器材和设备 5.1超净工作台。 5.2生物显微镜。 5.3PCR扩增仪。 5.4电泳仪及水平电泳槽。 5.5凝胶成像仪。 5.6微量移液器。 5.7 涡旋振荡器。 5.8 恒温培养箱。 5.97 离心机。 5. 10 ）微生物检测其他辅助设备和器械应符合SC/T7201.1一2006中第4章的要求， 6临床症状 患病罗非鱼缺乏活力，行动缓慢，食欲减退，离群独游于水面，死前出现间断性狂游、翻滚或转圈。患 病鱼体色发黑，单侧或双侧眼球突出，眼球充血，角膜浑浊，肛门红肿。鳃盖内侧和下缘、胸鳍基部和体表 其他部位有出血现象。有时急性患病鱼无明显外部症状。解剖可见肝脏淤血，严重时有坏死灶；脾脏肿 大，呈暗红色；胆囊肿大，肠道积水。罗非鱼链球菌病的流行特点参见附录B中的B.1。 7采样 7.1采样对象 罗非鱼及其变种（参见B.2)。 7.2采样数量 应符合SC/T7014—2006中6.1的规定。 7.3个体要求 应符合SC/T7014—2006中6.2的规定。 8 细菌分离与纯化培养 以无菌操作方式，分别从脑、肾脏、肝脏、脾脏等器官组织中取少量组织划线接种于血琼脂平板（见 A.2)，28℃～30℃倒置培养24h～48h。待长出菌落后，用无菌接种环挑取单个菌落接种于脑心浸液肉 汤培养基平板（见A.1)上，28℃～30℃倒置培养24h，重复划线至少3次，直至菌落完全纯化， 9 生理生化鉴定 9.1革兰氏染色 应符合SC/T7014—2006中9.3的规定。 9.2运动性试验 2 SC/T7235—2020 待检菌穿刺接种于半固体琼脂，28℃培养48h。 9.3糖类醇类发酵试验 用接种环挑取单个菌落少许，分别接种甘露醇、山梨醇、棉子糖、乳糖、菊糖、水杨苷、海藻糖、蔗糖、葡 萄糖、淀粉10种发酵试验管。28℃培养24h后观察。 9.4七叶苷水解试验 待检菌株接种于七叶苷培养基中（见A.9)，35℃培养24h后观察。 9.5过氧化氢酶（接触酶）试验 挑取待检菌落于洁净的载玻片上，滴加适量的3%过氧化氢溶液（见A.8），观察是否有气泡产生。 9.6CAMP试验 在血琼脂平板上，先将金黄色葡萄球菌（ATCC25923）沿直径划线接种，再沿该线垂直方向接种待测 菌，两线不得相接，间隔3mm 4mm.3 9.7V.P试验 应符合SC/T7014 2000 9.8精氨酸水解试 挑取单个菌落 接种到精 辉酶细菌生化鉴定管 9.9马尿酸水解试验 应符合GB 78 9.10表型和生 理 结果判定 9.10.1分离 的表型 R 细菌染色和生理生化试验结果判定 生理生化反 D 日性（ 革兰氏染1 休 运动性试 上，边缘清晰 糖类醇类发酵 紫色 七叶苷水解试 皇褐色 过氧化氢酶试 生 CAMP试验 头状溶血 V.P试验 红色 变为红色 精氨酸水解试验 红 黄色或不变色 马尿酸水解试验 星深紫 变色或呈淡紫色 9.10.2分离菌株在脑心 琼脂培 养48h后，形成 色、湿润、易乳化的菌落， 菌体革兰氏染色为阳性，生理 七试验结果 2相 注：无乳链球菌的生理生化鉴定可 同等鉴定效果的商品化细菌生化监 条 表2 无乳链球菌的 的生理生化特征 反应项目 结果 反应项目 结果 反应项目 结果 运动性 水杨苷 d 七叶苷 甘露醇 海藻糖 + 过氧化氢酶 + 山梨醇 D-核糖 十 CAMP试验 十 棉子糖 煎糖 + V.P试验 + 乳糖 P 葡萄糖 十 精氨酸水解 + 菊糖 淀粉 马尿酸水解 + 注：十表示≥90%菌株为阳性；一表示≥90%菌株为阴性；d表示11%~89%菌株为阳性。 9.10.3分离菌株在脑心浸液琼脂培养基上28℃～30℃培养48h后，形成灰白色、湿润、易乳化的菌落， 菌体革兰氏染色为阳性，生理生化试验结果与表3相符，可初步判定为海豚链球菌。 注：海豚链球菌的生理生化鉴定可采用同等鉴定效果的商品化细菌生化鉴定试剂条。 3 SC/T7235—2020 表3海豚链球菌的生理生化特征 反应项目 结果 反应项目 结果 反应项目 结果 运动性 水杨苷 + 七叶苷 + 甘露醇 + 海藻糖 + 过氧化氢酶 山梨醇 D-核糖 + CAMP试验 + 棉子糖 煎糖 + V.P试验 乳糖 葡萄糖 + 精氨酸水解 + 菊糖 淀粉 十 马尿酸水解 注：十表示≥90%菌株为阳性；一表示≥90%菌株为阴性。 10 PCR检测 10.1DNA提取 10.1.1将分离纯化的待检菌接种于BHI液体培养基中以28℃摇床培养48h。 10.1.2取2mL待检菌培养液，12000r/min离心1min收集菌体。 10.1.3菌体悬浮于500μLTE缓冲液（pH8.0)（见A.3)，振荡悬浮，加人50μL10%的SDS溶液（见 A.4)，10μL20mg/mL的蛋白酶K（见A.5），混匀，37℃温育1h。 10.1.4加人100μL5mol/L的NaCI溶液（见A.10），充分混匀，再加人100uLCTAB/NaCI溶液（见 A.6），混匀，65℃温育20min。 10.1.5加人等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1)（见A.11)，混匀，12000r/min离心5min。 10.1.6取上清液加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1)（见A.12)，混匀，12000r/min离心5min。 10.1.7取上清液，加入1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止10min，10000r/min离心10min；沉淀 用70%酒精洗涤2次，室温晾干。 10.1.8加入50μL的TE缓冲液溶解，一20℃保存，备用。 注：细菌基因组DNA的提取可以采用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒，按照说明书方法进行提取。 10.2PCR扩增 10.2.1引物 16SrRNA基因DNA序列PCR扩增引物分别为27F和1492R，引物用无菌去离子水稀释后于 20℃保存备用。 10.2.2PCR反应体系 按照表4的要求，在PCR管中加入相应的试剂，混匀后3000r/min离心30s。如使用无热盖的PCR 扩增仪，需在反应混合物上加2滴矿物油。设阳性对照和阴性对照，阳性对照的模板为无乳链球菌参考菌 株基因组DNA，阴性对照取等体积的双蒸水代替DNA模板。 表4PCR反应预混物所需试剂与组成 试剂 50μL体系 试剂终浓度 10XPCR缓冲液（无Mg+） 5. 0 μL, 1×PCR缓冲液 Mg